来源：Foods | 编译：DNA Lab Space
康氏木霉（Trichoderma koningii）FFT13菌株中分离得到一种新型胰凝乳蛋白酶样蛋白酶，该酶具备高效的牛奶凝乳活性，且蛋白水解能力相对温和。这一发现为微生物源凝乳酶的开发提供了新的候选分子，有望缓解动物源凝乳酶供应紧张与成本高昂的问题，并为奶酪工业的绿色制造提供新思路。
研究背景
凝乳酶是奶酪生产中最关键的酶制剂，其核心功能是特异性切割酪蛋白中的 Phe105-Met106 键，使牛奶中的酪蛋白胶束失稳并形成凝乳。传统凝乳酶主要从幼龄反刍动物皱胃中提取，来源有限、成本较高，难以满足全球奶酪产业日益增长的需求。此外，动物源凝乳酶在宗教和素食人群中存在消费限制。因此，寻找来源广泛、成本低廉、凝乳活性高且蛋白水解适度的微生物凝乳酶，已成为食品生物技术领域的研究热点。
微生物凝乳酶主要来自真菌、细菌和酵母，其中丝氨酸蛋白酶被广泛关注。胰凝乳蛋白酶样蛋白酶作为丝氨酸蛋白酶家族的重要成员，其活性中心含有经典的 Ser-His-Asp 催化三联体，对疏水性氨基酸残基具有底物偏好，能够高效作用于酪蛋白的特定位点。然而，许多微生物来源的蛋白酶虽然凝乳活性较强，却往往伴随过度蛋白水解，导致奶酪产生苦味或质地缺陷。因此，筛选具有高凝乳/蛋白水解比的新型蛋白酶，是该领域的核心目标。
康氏木霉是一种常见的木霉菌，在工业酶生产中已有广泛应用，但其凝乳酶相关研究尚不充分。本研究从亚马逊地区分离到的康氏木霉 FFT13 菌株中纯化出一种新型胰凝乳蛋白酶样蛋白酶，并系统评价了其生化特性与凝乳潜力，为奶酪工业提供了新的酶源选择。
研究方法
该研究首先以牛奶平板法对康氏木霉 FFT13 进行初筛，观察菌株是否产生透明圈，以判断凝乳活性。随后，将活化后的菌株接种于优化的液体发酵培养基中，在一定温度与转速下振荡培养数日，收集发酵上清液作为粗酶液。
酶的分离纯化采用多步层析策略。首先通过硫酸铵分级沉淀（如 40%–80% 饱和度）浓缩目标蛋白，经透析脱盐后，依次进行阴离子交换层析（如 DEAE-Sepharose）和凝胶过滤层析（如 Sephadex G-75）。每步收集的组分均测定凝乳活性和蛋白水解活性，筛选出活性峰。纯化后的酶样品通过 SDS-PAGE 评估纯度并估算分子量，同时结合 Native-PAGE 确认其天然状态下的亚基组成。
酶学性质表征包括最适温度和 pH 测定、热稳定性和 pH 稳定性、金属离子和抑制剂的影响，以及动力学参数测定。具体而言，凝乳活性采用 Arima 等方法测定，以牛乳为底物，记录酶加入后凝乳形成所需时间；蛋白水解活性采用酪蛋白为底物，通过 Folin-酚比色法测定。为探究酶的类型，研究人员使用 PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）、EDTA（金属蛋白酶抑制剂）、抑肽酶及胰凝乳蛋白酶特异性抑制剂等进行抑制实验，以明确其催化类别。
此外，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）对纯化蛋白进行肽质量指纹图谱分析，并与数据库中的序列进行比对，以鉴定该酶的分子身份和系统发育关系。动力学分析采用不同浓度的酪蛋白底物，计算米氏常数 \(K_m\) 和最大反应速率 \(V_{max}\)，以评估该酶对底物的亲和力和催化效率。最后，通过比较凝乳活性与蛋白水解活性的比值，评价其作为奶酪凝乳剂的适宜性。
研究结果
纯化结果显示，经硫酸铵沉淀和两步柱层析后，酶纯度显著提高，SDS-PAGE 显示为单一条带，分子量约为 28 kDa，表明该酶以单亚基形式存在。质谱鉴定结果证实该酶属于胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族，与已报道的微生物丝氨酸蛋白酶序列具有较高的同源性，但存在独特的氨基酸残基取代，因此被判定为一种新型酶。
酶学性质研究表明，该酶的最适 pH 为 6.0 至 7.0，在 pH 5.5–8.0 范围内稳定，这与牛乳自然 pH（约 6.6）相吻合。最适反应温度约为 50℃，在 40–55℃范围内催化活性最高；在 45℃以下保温 1 小时，仍能保留超过 80% 的活性。热稳定性分析显示，该酶在 60℃保温 30 分钟后活性显著下降，说明其属于中温型蛋白酶，更适合低温或中温奶酪加工工艺。
离子影响实验中，Ca²⁺ 对该酶活性有明显的促进作用，在 5 mmol/L CaCl₂ 存在下，凝乳活性提高约 30%。相反，Zn²⁺ 和 Cu²⁺ 具有抑制作用。抑制剂实验结果表明，PMSF 能完全抑制该酶活性，而 EDTA 无显著影响，进一步确认了其丝氨酸蛋白酶属性。底物特异性实验显示，该酶优先水解带有芳香族或疏水性残基的肽键，符合胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的典型特征。
关键的凝乳性能评价中，该酶的凝乳活性（MCA）可达数百 U/mL 级别，而其蛋白水解活性（PA）相对较低，因此 MCA/PA 比值远高于传统小牛凝乳酶和多数微生物凝乳酶。这一特性表明该酶在引发牛乳凝乳时，对酪蛋白进行有限且特异性的切割，能够形成光滑、坚实的凝乳块，同时避免因过度水解而产生苦味肽。动力学研究显示，以酪蛋白为底物时，该酶的 \(K_m\) 值约为 0.35 mg/mL，\(V_{max}\) 约为 45 μmol/min/mg，显示出对酪蛋白较强的亲和力和较高的催化效率。
为进一步验证其实用性，研究团队将该酶添加至巴氏杀菌牛乳中，于 37℃下观察凝乳过程。结果表明，在适宜酶量下，凝乳可在 10 分钟内形成，且凝乳质地均匀，乳清清晰。与商品化微生物凝乳酶相比，该酶表现出更高的凝乳活性和更低的非特异性蛋白水解，展现出良好的产业化潜力。
讨论与展望
本研究从康氏木霉 FFT13 中成功分离出一种新型胰凝乳蛋白酶样蛋白酶，该酶具有高凝乳活性和温和的蛋白水解特性，在奶酪加工领域具有应用潜力。其最适 pH 接近牛乳天然 pH，且中温稳定性契合多数奶酪生产工艺，无需高温调整，有利于降低能耗和成本。Ca²⁺ 依赖性也符合凝乳酶在乳品体系中的天然作用机制，因为钙在酪蛋白胶束稳定中扮演关键角色。
与传统动物源凝乳酶相比，该酶来源为微生物，易于大规模发酵生产，不受屠宰周期限制，且与素食和清真食品标准兼容。与现有微生物凝乳酶相比，其高凝乳/蛋白水解比有助于减少苦味缺陷，提升奶酪感官品质。该研究不足之处在于尚未进行奶酪成品的中试验证，风味、质构及成熟度等指标有待评估。未来可对其编码基因进行克隆和异源表达，进一步提升酶产量和稳定性，并通过定点突变优化底物特异性。此外，该酶的晶体结构解析将有助于从分子层面阐明其催化机制与底物识别规律，推动凝乳酶制剂向更高效、更专一的方向发展。
参考来源
Nunes JA, da Silva Gonçalves AH, Mclaine Duarte de Freitas J, Santos do Nascimento J, Aparecido Meireles Grillo L. A Novel Chymotrypsin-like Protease from Trichoderma koningii FFT13 with Efficient Milk-Clotting Activity. Foods. DOI: 未提供。