来源：Nucleic Acids Res | 编译：DNA Lab Space
精准解析细胞命运决定过程是发育生物学和肿瘤研究的前沿课题，而大规模谱系追踪技术是连接基因型与细胞身份的关键桥梁。然而，现有基于Cas9核酸酶的谱系记录工具在哺乳动物系统中常因双链断裂毒性、编辑效率不足及致死性旁路突变而受限。本研究报道了一种名为BASELINE的CRISPR碱基编辑谱系追踪平台，利用胞嘧啶碱基编辑器在不产生DNA双链断裂的前提下，在哺乳动物基因组中合成可遗传的多重编辑标记，并通过单细胞测序直接读取谱系信息。该平台兼顾了编辑多样性和细胞存活率，为在哺乳动物尺度破译发育和疾病过程中的克隆动态提供了全新的技术范式。
研究背景
细胞谱系追踪旨在记录单个祖先细胞及其后代的分化与迁移历程，是理解器官形成、组织再生及肿瘤演化的重要工具。早期方法依赖染料示踪或Cre/loxP系统的随机重组，但标记种类有限，难以实现高通量的谱系重建。随着单细胞测序技术的发展，基于CRISPR-Cas9的DNA条形码策略应运而生：通过Cas9核酸酶在基因组特定位点引入插入缺失突变，使每个细胞获得独特的编辑组合，随后通过测序读取这些组合来构建谱系树。然而，该策略在哺乳动物细胞中面临显著瓶颈——Cas9切割DNA双链会导致p53通路的激活，引发细胞周期阻滞或凋亡，严重降低了细胞活力和记录效率。同时，核酸酶介导的修复产物常包含较大片段缺失，不仅增加了后续比对难度，还可能干扰细胞内源基因的功能。
为克服上述缺陷，研究人员尝试将碱基编辑技术引入谱系追踪领域。碱基编辑器由脱氨酶与Cas nickase融合而成，能够在不切断DNA双链的情况下实现单碱基替换，例如C·G到T·A的转换。理论上，碱基编辑可以产生丰富的突变位点，且细胞毒性较低，非常适合长期、多轮的谱系标记。然而，如何在哺乳动物基因组中高效地写入足够数量的可信息编辑位点，并确保这些编辑在单细胞测序中可被准确读取，仍是一个关键难点。BASELINE平台的问世，正是针对这一技术空白而开发的解决方案。
研究方法
BASELINE平台的设计遵循“多位点、可累积、可读取”的原则。首先，研究人员构建了一个包含多个靶向编辑位点的报告基因阵列，每个靶位点内设计有数个适合胞嘧啶碱基编辑器作用的motif（即位于编辑窗口内的胞嘧啶）。这些位点被整合到哺乳动物细胞的基因组中，作为谱系记录的内存寄存器。为了提高编辑多样性，他们采用了多重sgRNA表达策略，将一组特异性引导RNA组装到载体中，共同递送至目标细胞。在细胞增殖过程中，碱基编辑器在sgRNA的引导下逐步将这些胞嘧啶转换为胸腺嘧啶，形成组合式的突变指纹。由于编辑事件可随细胞分裂逐渐累积，子代细胞将继承并扩展其母细胞的编辑状态，从而实现谱系信息的“写入”。同时，研究团队构建了相应的计算流程，对单细胞测序数据进行编辑位点检测和谱系树重建。
实验流程上，作者首先在细胞系中验证了平台的基本性能，利用慢病毒将BASELINE系统导入人胚胎肾细胞或小鼠成纤维细胞，并在不同时间点采集样本进行靶向扩增子测序。随后，他们将平台移植到更具生理相关性的模型中，例如小鼠造血干细胞或类器官培养系统，进一步评估其在体内环境下的标记效率和细胞耐受性。在单细胞分辨率层面，研究整合了单细胞RNA测序与靶位点扩增子测序，使每个细胞的转录组信息与其谱系条形码相关联。通过这种多组学策略，BASELINE不仅能够追踪细胞谱系关系，还能同时揭示各谱系细胞的基因表达状态，为理解命运决定机制提供了直接证据。整个实验流程的技术路线如图所示。
研究结果
研究结果显示，BASELINE平台在哺乳动物细胞中实现了高效且低毒性的谱系标记。与传统的Cas9核酸酶系统相比，碱基编辑显著降低了细胞凋亡率，并减少了DNA损伤应答通路的激活。在相同培养条件下，表达BASELINE的细胞群体表现出更高的存活率和增殖速率，表明该系统对细胞生理状态的干扰较小。在编辑多样性方面，经过数轮细胞分裂后，每个细胞积累了多种可重复检测的碱基替换，编辑位点的组合数随着培养时间呈指数增长，能够编码的信息容量远超传统Cas9系统。通过靶向扩增子测序，研究人员在数千个单细胞中检测到了高度特异的编辑模式，并成功重建了包含多级分支结构的谱系树。谱系树拓扑准确性与通过物理混合实验建立的已知克隆关系高度一致，证明了该平台在谱系推断中的可靠性。
更重要的是，BASELINE平台被成功应用于复杂的哺乳动物模型。在造血系统和小鼠类器官中，平台均能稳定运行数周，并能在单细胞水平同时捕获谱系信息和转录组变化。展示了在移植实验后不同组织中检测到的编辑组合分布情况，显示了清晰的器官间克隆扩散和局部扩增特征。此外，在分化过程中，研究团队观察到一些谱系限制性编辑模式与特定的细胞亚群表达程序高度相关，说明该平台可用于绘制细胞命运的连续轨迹。进一步对比了不同谱系追踪策略的编辑效率和细胞毒性，数据表明BASELINE在保持高标记多样性的同时，大幅降低了检测窗口内的背景突变和偏差，使得低丰度克隆也能被准确识别。这些数据整体确立了BASELINE作为哺乳动物单细胞谱系追踪工具的性能优势。
讨论与展望
BASELINE平台的突破在于其将“无损编辑”与“高通量读取”有效结合，化解了哺乳动物谱系追踪中长期存在的技术权衡。碱基编辑不产生双链断裂，避免了p53介导的细胞应激，使细胞在天然生理状态下被动记录自身历史，从而获得更真实、更完整的发育轨迹。该平台对类器官和体内系统的兼容性，也为其应用于肿瘤进化和免疫细胞克隆动力学研究铺平了道路。然而，当前版本仍存在一些局限：碱基编辑可用的靶向基序受限于PAM序列和编辑窗口的序列偏好；另外，单细胞测序中的扩增覆盖不均可能影响编辑位点的完整检出。未来可通过引入更高效的腺嘌呤碱基编辑器或工程化脱氨酶，进一步扩展可编辑位点种类和密度；也可利用基因递送和活体成像技术，使谱系记录从终点分析走向实时监测。总体而言，BASELINE作为一项全新的DNA记录平台，将推动我们以更高的分辨率和更低的系统扰动，去解码多细胞生命体的发育逻辑。
参考来源
期刊：Nucleic Acids Research
DOI：原文出版信息待补充，请以正式版本为准。