来源：Int J Mol Sci | 编译：DNA Lab Space
深海冷泉沉积环境孕育着独特的真菌资源，其隐蔽的次级代谢途径蕴含丰富的化学多样性。本研究通过基因组挖掘策略，从深海冷泉来源真菌中鉴定出一个新颖的漆酶-束蛋白融合酶系统，该酶能够催化萘并吡喃酮单体发生区域选择性二聚化，生成不同连接方式的二聚体产物。这一发现拓展了对深海真菌生物合成酶催化机制的理解，为开发新型区域选择性二聚化工具酶提供了重要资源。
研究背景
萘并吡喃酮类化合物是一类结构多样的聚酮类天然产物，广泛存在于真菌和植物中，具有抗炎、抗菌、细胞毒等多种生物活性。这类化合物的二聚体往往表现出比单体更为显著或独特的药理活性，然而其生物合成途径中负责区域选择性二聚化的关键酶长期以来尚未被充分阐明。真菌漆酶（laccase）属于多铜氧化酶家族，能够催化酚类底物的单电子氧化，并介导自由基偶联反应。然而，漆酶在体内如何实现对特定底物的区域选择性控制，仍是一个悬而未决的科学问题。
近年来，基因组挖掘技术的快速发展为发现新型生物合成酶提供了强大工具。深海冷泉作为一类独特的极端海洋生态系统，其微生物资源尚未被充分开发，尤其是丝状真菌的次级代谢潜力仍是一个有待探索的广阔领域。本研究以深海冷泉沉积物来源的真菌菌株为对象，运用基因组挖掘策略，以期发现催化萘并吡喃酮二聚化的新型酶系，阐明其催化机制，为天然产物结构多样化研究提供新的酶学工具。
研究方法
研究人员首先从深海冷泉沉积物中分离获得一株真菌菌株，经形态学观察和ITS序列系统发育分析确定为曲霉属（Aspergillus sp.）成员。对该菌株进行全基因组测序，利用antiSMASH等生物信息学工具进行次级代谢产物生物合成基因簇预测分析，重点关注含多铜氧化酶结构域的基因簇。经过功能注释和结构域分析，研究人员锁定了一个同时编码漆酶结构域和束蛋白（fasciclin）结构域的融合基因，该基因簇还包含两个萘并吡喃酮骨架合成所需的聚酮合酶基因以及一个O-甲基转移酶基因。
为验证该融合基因的功能，研究人员将该基因簇在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）异源宿主中进行组合表达。具体而言，将聚酮合酶基因、O-甲基转移酶基因和漆酶-束蛋白融合基因分别克隆至表达载体中，共转化构巢曲霉，通过高效液相色谱（HPLC）分析转化菌株的代谢产物谱。随后，研究人员进一步将漆酶-束蛋白融合蛋白在毕赤酵母（Pichia pastoris）中异源表达，获得纯化的重组蛋白用于体外酶学表征实验。为了考察束蛋白结构域的作用，他们还构建了仅含漆酶结构域而不含束蛋白结构域的截短突变体，并比较了两种酶的催化活性、底物特异性及产物选择性。
体外酶促反应以纯化的萘并吡喃酮单体（flavasperone）为底物，在不同pH、温度、铜离子浓度条件下测定酶活，确定最佳反应条件。反应产物经制备型液相色谱分离纯化后，通过核磁共振（NMR）、高分辨质谱（HRESIMS）和圆二色谱（CD）等手段进行结构鉴定，确定产物的连接位点和立体构型。此外，研究人员还通过分子对接和定点突变实验，初步探究了漆酶-束蛋白融合酶区域选择性的结构基础。
研究结果
基因组分析结果显示，该深海冷泉曲霉菌株携带一个此前未表征的基因簇，其中的核心酶为一个由N端漆酶结构域和C端束蛋白结构域组成的融合蛋白，将其命名为AfLac-Fas。异源表达实验结果表明，在构巢曲霉中同时表达聚酮合酶、O-甲基转移酶和AfLac-Fas时，能够检测到萘并吡喃酮二聚体的产生，而对照组（不表达AfLac-Fas）中仅有单体积累，证实了该融合酶参与二聚化过程。
体外酶学表征发现，纯化的AfLac-Fas重组蛋白能够在pH 5.5、30°C条件下有效催化flavasperone单体的氧化偶联，反应需要铜离子参与。产物分离鉴定结果表明，AfLac-Fas催化flavasperone二聚化主要生成一个对称的二聚体产物，经NMR结构解析确定为C-C连接的二聚萘并吡喃酮。值得关注的是，当去除C端束蛋白结构域后，仅保留漆酶结构域的截短突变体虽然仍保留氧化活性，但其催化flavasperone二聚化时产物谱发生了显著改变——不再选择性地生成上述单一偶联产物，而是产生多个偶联位点不同的异构体混合物。这一结果清楚地表明，束蛋白结构域在决定二聚化位点选择性方面发挥着关键作用。
进一步的底物谱分析显示，AfLac-Fas对多种不同的萘并吡喃酮单体底物均表现出二聚化活性，但对底物结构的变化较为敏感——苯环上取代基模式的不同会显著影响偶联效率和产物选择性。分子对接模拟结果揭示了束蛋白结构域可能通过形成底物结合口袋，以特定的方式锚定萘并吡喃酮分子，限制其氧化自由基中间体的取向，从而实现位点专一的C-C偶联。
讨论与展望
本研究从深海冷泉真菌中发现了一个独特的漆酶-束蛋白融合酶系统，揭示了束蛋白结构域在漆酶催化萘并吡喃酮二聚化过程中对区域选择性的决定性作用。这一发现不仅拓展了我们对漆酶家族酶催化功能多样性的认识，也为理解自然界中蛋白质融合如何在进化中赋予生物合成酶新的催化特性提供了一个生动的范例。从应用角度看，AfLac-Fas作为一种可在异源宿主中功能表达的可溶性酶，有望发展为一种高效的体外二聚化工具酶，用于制备结构多样的萘并吡喃酮二聚体化合物库，服务于药物先导化合物的发现。
然而，目前对于束蛋白结构域如何精确识别底物并调控偶联位点的分子机制仍需要更精细的结构生物学研究加以阐释。未来的工作可通过解析AfLac-Fas与底物复合物的晶体结构或冷冻电镜结构，结合更系统的定点突变分析，全面揭示该酶区域选择性的结构决定因素。同时，鉴于深海冷泉环境中蕴含着大量未被挖掘的真菌资源和生物合成基因簇，本研究也为进一步开发深海真菌天然产物提供了新思路。
参考来源
Li H, Li Z, Sun J, Yang X, Xing K. Genome Mining of Deep-Sea Cold Seep-Derived Fungus Reveals a Laccase-Fasciclin System Modulating Regioselective Naphthopyranone Dimerization. International Journal of Molecular Sciences. DOI: 待补充（以期刊正式刊出信息为准）。