来源：Nucleic Acids Res | 编译：DNA Lab Space
细胞谱系追踪是生命科学中解析组织发育、器官稳态与疾病起源的核心手段。传统基于CRISPR-Cas9切割的谱系记录方法虽可在基因组中引入随机突变作为“分子条码”，但DNA双链断裂带来的细胞毒性和基因组不稳定，严重制约了其在哺乳动物活体体系中的规模化应用。新近发展的BASELINE平台采用CRISPR碱基编辑技术，在不切断DNA的情况下持续积累可遗传的碱基替换，实现了哺乳动物层面高分辨率、低干扰的单细胞谱系追踪，为发育生物学和肿瘤研究提供了有力工具。
研究背景
理解一个复杂多细胞生物体中每一个细胞的祖先历史，是揭示发育程序和疾病演进的关键。细胞谱系追踪技术经历了从荧光染料标记、Cre重组酶报告系统到基于CRISPR的遗传条形码技术的发展。特别是基于CRISPR-Cas9的编辑系统，能够在目标位点产生随机插入缺失（indels），作为克隆标记被后续单细胞测序读取，从而重建谱系树。然而，Cas9切割引入DNA双链断裂（DSB）会激活p53通路和DNA损伤应答，导致细胞周期阻滞或凋亡，尤其在体内原代细胞和多能干细胞中表现明显。这使得长时间、多轮的谱系记录效率下降，难以覆盖哺乳动物复杂组织的大规模细胞群体。
碱基编辑器的出现为这一难题提供了变革性解决方案。腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（CBE）能在不产生DSB的条件下实现A→G或C→T的精准替换。若将碱基编辑靶点设计为可重复编辑的串行序列，便可在细胞分裂过程中逐步累积突变，形成“活细胞历史记录仪”。BASELINE正是基于这一思路，构建了一套完整的碱基编辑谱系追踪平台，旨在克服Cas9切割方法的固有局限，实现哺乳动物规模的单细胞谱系解析。
研究方法
BASELINE平台的技术路线围绕“碱基编辑条形码的写入、读取与谱系重建”三个核心环节展开。
首先，研究人员设计了一个合成的“编辑靶点阵列”，该阵列由多个高度相似的碱基编辑靶位点串联组成。每个靶位点均包含一个被设计为可被CBE或ABE作用的序列基序，这些基序在空间上排列成可重复编辑的密码区域，确保多轮编辑后仍能够被稳定读取。该阵列被克隆入慢病毒载体，并整合到哺乳动物细胞基因组的“安全港”位点，以保证长期稳定遗传且不受内源转录干扰。
其次，在写入环节，细胞被工程化以稳定表达碱基编辑器。BASELINE采用诱导型或组成型表达策略，结合细胞分裂偶联的编辑动力学，使得每一次细胞分裂过程中，碱基编辑器在靶点阵列上随机引入新的C→T或A→G突变。这些突变一旦产生便稳定遗传，随着分裂代数增加，整个阵列上的突变模式构成一个不断扩展的“彩色条形码”，记录细胞分裂历史。通过调控碱基编辑器的表达水平和编辑时长，可以调整条形码的分辨率和覆盖深度。
然后是在单细胞水平读取条形码。研究团队优化了基于微流控的单细胞靶向扩增测序流程，能够在每个细胞中特异性扩增碱基编辑靶点区域，并利用下一代测序获得每个细胞的编辑状态矩阵。该步骤的核心在于高灵敏度和低错误率，以确保真实低频突变能够与测序噪声区分。
最后，研究团队开发了配套的生物信息学分析流水线。该流水线首先对每个细胞的编辑矩阵进行质量过滤与噪声校正，然后利用共享突变模式构建单细胞谱系树。由于碱基编辑突变具有不可逆性和累积性，同一祖先细胞的后代将共享一组独特的编辑组合，从而可以推断出确切的亲缘关系。流程中还整合了针对缺失数据、扩增偏好和并行编辑事件的计算模型，以提升谱系重建的准确性。
研究结果
基于上述技术路线，BASELINE平台展示出显著的性能优势。在体外培养的小鼠胚胎干细胞和人类细胞系中，该平台能够实现持续多轮的碱基编辑记录，靶点阵列的编辑位点数量随着细胞分裂逐步增加，单个细胞中可检测到数十个独立的编辑事件。与传统的Cas9切割系统相比，BASELINE在保持高编辑活性的同时，显著降低了细胞凋亡和增殖抑制。研究人员通过比较实验发现，经碱基编辑处理的细胞其存活率和克隆形成能力远高于经Cas9处理的细胞，表明无DSB的编辑机制极大减轻了对哺乳动物细胞的遗传毒性。
在单细胞追踪精度方面，BASELINE成功地对培养体系中的数千个细胞进行了谱系重建。重建得到的谱系树具有高自洽性，能够正确区分实验混入的不同克隆，并且与已知的细胞增殖模式相吻合。更重要的是，该平台支持在较长时间尺度上持续记录，即使经过数十次细胞分裂，条形码的多样性仍足以区分不同谱系分支。
研究人员还进一步在类器官和体内移植模型中验证了BASELINE的适用性。在类器官培养中，平台可追溯从干细胞到分化祖细胞乃至终末分化细胞的完整谱系关系，所得到的谱系树与已知的分化层级具有高度一致性。在体内实验中，经过碱基编辑的细胞在小鼠组织内能稳定存活并持续编辑，没有观察到明显炎症反应或组织病理异常。这些结果证明BASELINE具有在哺乳动物活体环境中进行大规模谱系追踪的潜力。
此外，数据分析流程的准确性也得到了验证。通过对已知混合比例的细胞群体进行谱系解码，系统计算的克隆大小与实际比例高度相关，表明来自不同祖先的细胞能够被准确分离和定量。这一特性使得BASELINE未来有望应用于肿瘤克隆演化、免疫细胞发育轨迹以及干细胞再生机制等领域的研究。
讨论与展望
BASELINE作为新一代基于碱基编辑的谱系追踪平台，其核心优势在于将谱系记录的“写入”过程从DNA断裂损伤中解放出来。相比CRISPR-Cas9系统，碱基编辑产生的突变类型更单一，更易于建模，且不会触发强烈的DNA损伤应答，因此更适合需要长时间