来源：aBIOTECH | 编译：DNA Lab Space
本氏烟（Nicotiana benthamiana）凭借快速的瞬时表达能力和独特的翻译后修饰机制，已成为植物合成生物学中最具潜力的异源表达底盘之一。该论文系统回顾了本氏烟代谢工程的发展历程，重点阐述了多基因组装、高效瞬时表达以及 CRISPR 基因编辑等工具在复杂天然产物生物合成中的应用，并展望了该平台在植物生物制造领域的未来方向。
研究背景中，植物天然产物长期以来是药物、香料和生物农药的重要来源，但许多高价值化合物在原生植物中含量极低，且化学合成难度大、成本高。代谢工程通过将异源生物合成途径导入模式植物，实现了这些化合物的人工从头合成。本氏烟之所以脱颖而出，主要归因于其天然存在 RdRp 基因突变导致的 RNA 沉默缺陷，从而能够支持外源基因的高水平表达。此外，其叶片生物量大、生长周期短、转化操作简便，且具备与哺乳动物细胞相近的蛋白质糖基化修饰能力，使得它不仅是重组蛋白生产的理想宿主，也成为植物天然产物研究的重要平台。该论文正是在这一背景下，整合了近年来利用本氏烟进行代谢工程改造的成果，提出了从基因操作到产物积累的系统性策略。
在研究方法方面，论文详细梳理了在本氏烟中开展代谢工程实验的标准化技术路线。首先，研究人员需要针对目标代谢途径进行设计，包括选择来源基因、进行密码子优化以及引入细胞色素 P450 等关键修饰酶。由于植物天然产物的生物合成往往涉及多个酶促步骤，多基因的共表达就显得尤为重要。近年来，基于 Golden Gate 和 MoClo 等模块化克隆策略的组装技术被广泛采用，允许将十余个基因构建到单个 T-DNA 载体中，通过农杆菌介导的叶片浸润实现多基因的瞬时共表达。与传统稳定转化相比，瞬时表达可在数天内完成基因表达和产物积累，极大缩短了实验周期，并且避开了基因整合位置效应造成的表达沉默。论文还强调了定量表达调控的作用，例如通过使用强启动子、叶绿体靶向信号肽以及 5' UTR 优化来提升翻译效率。此外，CRISPR/Cas9 技术被用于敲除内源竞争代谢途径，或引入定点突变以改善代谢流，进一步提升目标产物的产量。在分析方法上，LC-MS/MS 和 GC-MS 等质谱技术被用于代谢产物的定性和定量检测，结合稳定同位素标记进行代谢流分析，为途径优化提供了依据。
研究结果部分，该综述汇总了多个成功案例，生动展示了本氏烟作为“代谢工厂”的可行性与高效性。在萜类化合物合成方面，研究人员将源自红豆杉的紫杉醇生物合成基因模块导入本氏烟叶片中，成功实现了紫杉醇前体物的积累，并通过进一步共表达 P450 酶与辅因子再生系统，提高了氧化修饰效率。在黄酮类化合物合成中，通过瞬时共表达查尔酮合酶、查尔酮异构酶等基因，快速实现了柚皮素、花青素等产物的从无到有；同时，将整个途径与转录因子共同表达，显著激活了内源代谢前体通路，使产物含量得到成倍提升。另一类值得关注的成果是生物碱的异源合成，研究人员利用本氏烟重构了包括多个环化酶和甲基转移酶在内的复杂生物合成途径，成功产生了具有药用价值的单萜吲哚生物碱，尽管产量仍有提升空间，但已经证明该平台能够容纳高度复杂的多步催化体系。此外，论文还特别提到，通过将合成途径中的酶进行亚细胞区室化定位，如靶向质体或内质网，可以有效避开底物竞争，提高局部底物浓度，从而显著改善产物得率。这些结果表明，本氏烟同时具备途径重建、前体供给与产物修饰的能力，为药用化合物的快速验证和优化提供了高效平台。
在更广泛的应用层面，论文还报道了利用本氏烟生产倍半萜、二萜以及多不饱和脂肪酸等工业原料的尝试。例如，通过引入异源脂肪酸脱饱和酶，本氏烟叶绿体中可积累高水平的特殊脂肪酸。在合成策略方面，一个重要的发现是，将合成途径拆分为多个模块并在不同叶片或不同时间分别表达，可有效缓解代谢负担与产物毒性；而通过同时表达外排转运蛋白，可将部分目标产物分泌至质外体空间，从而减少胞内降解。论文强调，每一步优化都依赖于系统的定量检测与反馈调整，这种迭代式的工程策略已成为本氏烟代谢工程研究的典型范式。
讨论与展望部分，论文指出本氏烟代谢工程仍然面临若干挑战。首先，尽管瞬时表达效率高，但批次间叶片差异、农杆菌浸润条件以及环境因素均可能导致产量波动，制约了其规模化应用。其次，植物内源酶系常对外源中间产物进行降解或糖基化修饰，产生大量副产物，增加下游分离纯化的难度。此外，高表达外源蛋白可能诱发植物胁迫响应，导致叶片坏死或生长抑制，对产量造成负面影响。针对这些瓶颈，论文提出未来可结合合成生物学中的设计-构建-测试-学习循环，利用自动化平台和高通量筛选进一步提升构建效率。同时，将计算辅助的蛋白质工程引入关键酶的改造，有望提高其催化活性与底物特异性。随着本氏烟基因组信息的日益完善和基因编辑工具的进化，这一平台将在植物天然产物异源合成中释放更大潜力，成为连接实验室研究与工业化生产的理想桥梁。
参考来源：Kalalagh KF, Papon N, Courdavault V, van der Krol S, Kappers IF. Metabolic engineering in Nicotiana benthamiana. aBIOTECH, 2024. DOI: 10.1007/s42994-024-00198-0.