来源：Plants (Basel) | 编译：DNA Lab Space
甘薯基因组中天然整合有农杆菌Ri质粒来源的rol基因，然而这些“外来基因”在甘薯自身生长发育中的功能一直缺乏直接证据。本研究借助CRISPR/Cas9基因组编辑技术，对甘薯内源rolB和rolC基因进行定向敲除，成功获得了突变体根系，并发现rol基因的缺失会显著改变甘薯毛状根的形态发生、生长素/细胞分裂素平衡以及相关基因表达，首次从功能层面证实天然rol基因参与甘薯根系发育调控。
研究背景
在自然界中，部分植物基因组中存在来源于农杆菌的T-DNA片段，这种现象被称为“天然转基因”或“农杆菌化”。甘薯（Ipomoea batatas）是已知唯一在自然状态下稳定整合了农杆菌Ri质粒T-DNA的栽培作物，其基因组中含有完整的rolB、rolC等rol基因。长期以来，科学界对rol基因的研究主要集中于人工构建的转基因植物，例如将农杆菌rol基因转入烟草等异源植物后会诱导毛状根发生，并干扰植物激素信号通路。然而，rol基因在甘薯这一天然宿主中的生理功能却鲜有实验验证。
由于rol基因在甘薯品种间高度保守，且可能在驯化过程中受到选择，人们推测它们对甘薯的根系发育和产量形成具有重要作用。但受限于传统遗传操作手段，尤其是甘薯基因组复杂、同源基因冗余等问题，直接敲除内源rol基因并观察表型变化的技术难度较高。CRISPR/Cas9技术的应用为破解这一难题提供了可能。本研究正是利用该技术对甘薯内源rol基因进行功能解析，从而回答“天然rol基因究竟在做什么”这一关键科学问题。
研究方法
研究团队首先从甘薯栽培种基因组中克隆并鉴定了rolB和rolC基因的同源序列。通过多序列比对，确定其保守功能域，并据此设计特异性单导向RNA（sgRNA）。为保证编辑效率，每个基因分别设计两个靶位点，构建了携带双sgRNA的CRISPR/Cas9编辑载体。该载体以卡那霉素抗性基因作为筛选标记，同时引入绿色荧光蛋白（GFP）报告基因用于转化事件的可视化检测。
随后，研究者采用农杆菌介导的叶盘转化法将CRISPR/Cas9载体导入甘薯叶片外植体。经过共培养、抗生素筛选和不定芽诱导，获得独立的转化再生根系。由于甘薯转化周期较长，研究团队在早期阶段选择利用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）体系诱导毛状根，以加速突变体的获取。对获得的毛状根系，提取基因组DNA，利用靶位点两侧引物进行PCR扩增，并通过Sanger测序与TIDE（Tracking of Indels by Decomposition）分析，鉴定rolB和rolC基因的编辑类型，包括插入缺失片段、移码突变等。
在确认靶向编辑成功后，研究者对野生型与rol突变体毛状根进行了系统的表型比较，包括根长、侧根数目、根直径、鲜重等形态指标。同时采用高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，测定毛状根中吲哚-3-乙酸（IAA）、玉米素核苷等主要生长素与细胞分裂素类物质的含量。此外，还利用实时荧光定量PCR分析了rolB、rolC以及下游激素响应基因的表达变化，从而将基因编辑事件、激素水平变化与根系表型联系起来。
研究结果
测序结果显示，CRISPR/Cas9在rolB和rolC靶位点成功引入了多种类型突变，包括1～8 bp的碱基缺失和单碱基插入，突变频率因靶位点不同存在差异，总体编辑效率达到12%～34%。其中部分突变导致翻译提前终止，产生截短蛋白，推测丧失了rol蛋白的催化功能。鉴定到纯合或双等位基因突变的毛状根株系后，进一步对其进行了表型分析。
形态学测量显示，rolB突变体与野生型相比表现出明显的侧根增多表型，平均侧根密度提高了约1.8倍，且主根顶端优势减弱，根系呈“灌木状”向外扩张。与之相对，rolC突变体的主根长度显著缩短，平均根长仅为野生型的60%左右，根尖区域表现出异常的径向增粗，根直径增加约25%。这些结果表明，天然rolB基因对侧根发生具有抑制作用，而rolC基因则主要正向调控根的伸长生长。
激素定量分析揭示了上述表型的生理基础。在rolB突变体根系中，IAA含量较野生型降低了约35%，而细胞分裂素类物质，尤其是反式玉米素核苷（tZR）含量显著升高，达到野生型的2.3倍。IAA/细胞分裂素的比值显著下降，这与侧根大量发生相吻合。rolC突变体的情况相反，其IAA含量较野生型升高近50%，同时根部生长素输出载体PIN1基因的表达量下调，导致生长素在根尖过度积累，抑制了根的纵向伸长并促进径向膨大。
基因表达分析进一步显示，在rolB突变体中，细胞分裂素信号转导关键基因（如响应调节因子RR家族成员）的表达上调，而生长素响应因子ARF家族部分成员的表达受到抑制。令人关注的是，rolB和rolC之间存在一定的表达互作，rolB的编辑导致rolC表达水平下降，而rolC的编辑并未显著改变rolB的表达。这提示天然rolB与rolC可能位于同一条信号通路中，且rolB处于相对上游的位置。
此外，研究还发现rol基因的编辑对甘薯毛状根中次生代谢物的积累也产生了影响。总酚和黄酮类化合物的含量在rolB突变体中明显上升，而rolC突变体中则略有下降。这一结果表明天然rol基因并非沉默的化石序列，而是能够广泛参与植物初级与次生代谢调控的功能性基因。
讨论与展望
本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，首次在甘薯自身遗传背景下证明天然整合的rolB和rolC基因并非“无功能的残留DNA”，而是具有明确生物学功能、参与根系发育调控的活性基因。这一发现不仅深化了人们对水平基因转移在作物进化中作用的认识，也提示天然rol基因可能为甘薯的驯化与选育提供了某种适应性优势。
有意思的是，rolB突变导致侧根增加、rolC突变导致主根变短，而此前在异源植物中过表达rol基因的研究则显示它们能够强烈促进根系形成。这种功能上的反差说明，rol基因在不同宿主背景下可能发挥不同甚至相反的作用，天然整合状态下的基因剂量、启动子调控和遗传互作均会影响最终表型。未来需要进一步鉴定rol蛋白在甘薯细胞内的直接底物与互作蛋白，以阐明其分子机制。
另一方面，本实验利用的毛状根体系虽能快速评估基因功能，但与完整植株中rol基因的作用仍有差异。甘薯田间生产中主要依赖块根储存碳水化合物，rol基因是否影响块根的发育与产量，尚需通过稳定遗传转化获得再生植株进行长期观察。此外，编辑rolB/rolC时是否会影响其他T-DNA整合位点的基因表达，也需要进一步的表观遗传分析加以排除。
总之，这项研究为解析植物天然转基因事件的功能贡献了重要证据，也展示了CRISPR/Cas9在复杂基因组作物基因功能研究中的高效性与精确性。未来若能将rol基因的调控机制转化为育种策略，则有望为甘薯根系构型的定向改良提供新的分子靶点。
参考来源
Shkryl Y, Yaroshenko Y, Grigorchuk V, Bulgakov V, Yugay Y. Functional Analysis of Naturally Integrated Rol Genes in Sweet Potato via CRISPR/Cas9 Genome Editing. Plants (Basel). 2024;13(4):511. DOI: 10.3390/plants13040511.