来源：Front Microbiol | 编译：DNA Lab Space
5-氨基乙酰丙酸（ALA）是四吡咯类化合物共同的前体，在农业和医药领域具有广泛应用。然而，ALA生物合成中的关键限速酶——5-氨基乙酰丙酸合酶（ALAS）——活性较低且受产物抑制，限制了发酵效率。本研究的亮点在于构建了一种生长偶联的高通量筛选系统，将ALAS突变体的酶活性与谷氨酸棒状杆菌的细胞生长直接关联，从而在活细胞水平上定向富集高活性突变体，显著提升了ALA的合成能力。这一策略为酶分子进化中“基因型—表型”的高效桥接提供了新思路。
研究背景
ALA作为卟啉、血红素和维生素B12等四吡咯化合物的共同前体，被誉为“生命所需的基础分子”。在农业生产中，ALA可作为光动力除草剂和植物生长促进剂；在医学领域，其可用于光动力诊断和肿瘤光动力治疗。目前，ALA的生产方法包括化学合成和微生物发酵，其中微生物发酵法因其环境友好和可持续性而备受关注。谷氨酸棒状杆菌作为一种公认安全的工业微生物，具有清晰的遗传背景和成熟的代谢工程工具，已成为生产ALA的重要底盘菌株。
在ALA的生物合成途径中，5-氨基乙酰丙酸合酶（ALAS）催化甘氨酸与琥珀酰辅酶A发生缩合反应，生成ALA和辅酶A。该酶是通量控制的关键节点，其催化效率低、半衰期短，并受到产物ALA和终产物血红素的反馈抑制。传统的定向进化策略需要通过随机突变和微孔板筛选来鉴定高活性酶变体，但这种方法通量低、劳动强度大，且难以准确反映胞内催化性能。因此，开发一种将目标酶活性与细胞生长相偶联的选择系统，是突破ALAS定向进化瓶颈的关键。本研究着眼于在谷氨酸棒状杆菌中构建生长偶联筛选平台，从而高效获取对ALA合成有显著促进作用的ALAS突变体。
研究方法
研究中采用“易错PCR—突变体文库构建—生长偶联筛选—位点组合迭代”的技术路线。首先，研究人员利用易错PCR对来源于谷氨酸棒状杆菌的ALAS编码基因进行随机突变，建立容量可观的突变体文库。随后，将文库质粒转化至一个经过特殊改造的谷氨酸棒状杆菌宿主菌株中。该宿主菌株的内源hemA基因（编码ALA合酶）被置入受控表达元件，ALAS突变体的活性决定了细胞内血红素合成能力，进而直接影响菌株在无外源ALA补充条件下的生长速度。换言之，只有那些催化活性足以维持正常血红素需求量的ALAS突变体才能使宿主细胞正常生长；而失活或活性下降的突变体则因血红素缺陷而生长缓慢或无法存活。
为保证筛选压力足够大，研究设置了梯度性选择条件，通过逐步降低培养基中ALA和血红素的补充浓度，使细胞不得不依赖突变体自身的ALAS活性来维持生长。经过多轮“传代—稀释—富集”循环，高活性ALAS突变体在群体中的比例不断提高。从富集后的文库中随机挑取单菌落进行测序，鉴定出多个与酶活性密切相关的突变位点。随后，研究人员利用定点饱和突变和组合突变策略，将这些有益的突变位点进行叠加，并借助结构模拟分析突变对酶与底物结合口袋构象的影响。最后，在摇瓶和发酵罐水平上对最优突变株的ALA合成能力进行了验证，并通过实时定量PCR检测了相关基因的转录水平。
研究结果
研究结果表明，生长偶联筛选系统能够高效区分不同催化活性的ALAS突变体。在未施加选择压力时，初始文库中的阳性突变体比例较低；经过连续三轮生长富集后，携带功能型ALAS突变体的细胞在存活群体中的占比大幅上升，表明该系统具有强大的富集效率。
基于测序结果，研究人员发现多个突变位点集中在ALAS的底物结合区和二聚化界面上。其中，个别单点突变即可显著提高酶活性，而组合突变的效果更为突出。进一步的酶动力学分析显示，最优突变体的底物亲和力和催化速率均较野生型有明显改善，且对ALA的产物抑制作用表现出一定程度的耐受。在重组谷氨酸棒状杆菌中进行发酵验证时，表达最优组合突变体的工程菌株在摇瓶中ALA积累量显著高于对照菌株，且副产物积累减少，说明通量已更有效地导向ALA合成。
此外，对筛选过程中获得的中等活性突变体进行分析，揭示出ALAS耐受底物浓度和产物抑制的序列—结构关系。研究发现，某些突变通过增强辅酶A结合稳定性或扩大底物进入通道，从而提高了整体转化效率。组合后的突变体在培养后期仍能保持较高的ALAS合成速率，证明其稳定性优于野生型。通过分批补料发酵实验，最优菌株的ALA产量相较原始菌株提高了数倍，同时甘氨酸和琥珀酸等前体的利用效率得到优化，显示了良好的工业应用潜力。
值得注意的是，生长偶联系统还表现出一定的可扩展性。研究人员将最优突变体重新引入到额外需要血红素合成的异源表达体系中，相同策略仍然有效，进一步证实了该方法在代谢工程改造中的通用价值。通过对突变体的同源建模与分子对接分析，作者推测特定突变可能通过改变酶活性中心附近的氢键网络，稳定了催化过程中生成的中间过渡态，从而降低反应能垒。这些结果为后续的理性设计提供了清晰的结构生物学线索。
讨论与展望
本研究创新性地将生长偶联选择应用于ALA合酶的分子进化，成功规避了传统高通量筛选方法的低效性。与基于颜色或荧光的报告系统相比，生长偶联直接利用细胞生长速率作为输出信号，不仅简化了筛选流程，而且能从群体水平上精准富集最优突变体。这种方法对于在胞内环境中活性不稳定或受反馈调节的酶尤其有价值。
当然，本研究也存在一定局限性。例如，生长偶联筛选的选择压力与细胞生长速率相关，可能过滤掉一些体外活性高但胞内表达量低、或者对细胞代谢产生毒性的突变体；此外，由于筛选周期较长，可能诱发宿主基因组产生补偿性突变，从而干扰对ALAS突变体真实效果的判断。未来工作可结合连续定向进化设备实现自动化筛选，并通过工程化血红素调控网络进一步提高选择通量和灵敏度。总体而言，该研究不仅为谷氨酸棒状杆菌生产ALA提供了一系列高效的ALAS突变体，也展示了“生长偶联”作为通用筛选策略在代谢途径关键酶改造中的广阔前景。
参考来源
Frontiers in Microbiology (2024). DOI: 10.3389/fmicb.2024.（原文DOI以正式出版信息为准）