来源：J Anim Sci Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
青贮饲料是反刍动物日粮中不可或缺的粗饲料来源，而乳酸菌的发酵性能直接决定青贮品质。传统菌株筛选与诱变育种难以实现精准定向改良。近年来，CRISPR-Cas9基因编辑技术的崛起为乳酸菌功能基因组学研究和工业菌株改造提供了全新工具。该综述系统总结了CRISPR-Cas9在青贮用乳酸菌改良中的技术路线、应用现状及挑战，并展望了合成生物学驱动下的未来发展方向，为绿色畜牧业微生物制剂的精准开发提供了重要参考。
研究背景
青贮是通过乳酸菌在厌氧条件下发酵可溶性糖产生有机酸，使pH值迅速下降，从而抑制腐败菌和梭菌等有害微生物生长，实现饲料长期保存的技术。乳酸菌作为青贮发酵的核心驱动力，其产酸速率、耐酸能力、碳水化物利用谱及抑菌活性等性状与青贮品质密切相关。然而，自然界分离的野生乳酸菌往往存在产酸迟缓、环境胁迫耐受性差或代谢途径欠优化等缺陷，限制了优质青贮的生产。
传统的乳酸菌改良策略包括随机诱变和驯化筛选，虽在一定程度上可提升菌株性能，但突变位点不可控、效率低下，且易引入不良修饰。随着基因组测序和合成生物学的发展，精准基因编辑成为必然趋势。CRISPR-Cas9系统凭借其特异性强、操作简便、模块化设计等优势，已在多种微生物中实现高效基因敲除、敲入及碱基替换。将其应用于青贮乳酸菌的定向改造，不仅能够强化有益性状，还可消除潜在的安全风险，为开发高性能青贮接种剂开辟了新途径。
该综述聚焦CRISPR-Cas9技术在乳酸菌改良中的研究进展，系统梳理了技术原理、编辑策略、应用案例及面临的瓶颈，并提出了未来在青贮生产中的转化应用前景。
研究方法
该论文采用系统性文献综述方法，围绕“CRISPR-Cas9”、“Lactobacillus”、“silage”、“genome editing”等关键词，检索并筛选了近十年发表在Web of Science、PubMed等数据库中的高水平研究论文。作者通过归纳不同乳酸菌物种中已报道的CRISPR-Cas9编辑案例，提炼出适用于青贮乳酸菌改良的通用技术路线。
文中详述的CRISPR-Cas9实验流程主要包括：首先，通过基因组比对或转录组数据确定目标功能基因（如乳酸脱氢酶基因、苹果酸乳酸酶基因、抗菌肽合成基因等），并利用在线工具设计特异性单导向RNA（sgRNA）。其次，构建表达载体，使Cas9蛋白和sgRNA在宿主菌中共表达，同时提供同源修复模板以实现基因敲入或精确替换。接着，采用电穿孔法将载体导入乳酸菌细胞，利用同源重组或非同源末端连接修复双链断裂。随后，通过抗生素筛选和PCR测序验证编辑菌株，并进一步评估其生长曲线、产酸能力、耐酸性和抑菌活性。
针对乳酸菌转化效率低、同源重组效率不高等问题，论文还总结了多种优化策略，包括利用内源启动子增强Cas9表达、选择毒性sgRNA降低野生型细胞存活率、使用温度敏感型质粒实现编辑后载体消除，以及开发无外源DNA的核糖核蛋白递送系统。此外，论文还分析了CRISPR-Cas9与碱基编辑器、CRISPR干扰（CRISPRi）等衍生工具的结合潜力，为精细调控乳酸菌代谢网络提供多维方案。
研究结果
该综述揭示了CRISPR-Cas9在乳酸菌改良中的广泛应用潜力。目前，已成功编辑的乳酸菌包括植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）等青贮常见菌种。核心结果表明，通过基因敲除或过表达特定代谢酶，可显著提高乳酸产量和青贮发酵效率。
一项典型案例中，研究者利用CRISPR-Cas9敲除植物乳杆菌中的D-乳酸脱氢酶基因，使L-乳酸纯度达到99%以上，同时提高了菌株在酸性环境中的存活能力。另一项研究将来源于其他细菌的纤维素酶基因整合至乳酸菌基因组，使青贮原料中的纤维降解率明显提升，有效改善了饲料消化率。此外，通过敲除乳酸菌中的精氨酸脱亚胺酶基因，减少了青贮过程中氨氮的生成，从而保留更多蛋白质营养价值。
在菌株安全性改良方面，CRISPR-Cas9成功实现了乳酸菌中抗生素耐药基因的定向清除，为构建食品安全级青贮接种剂奠定了基础。同时，该技术还被用于增强乳酸菌的细菌素合成能力，以抑制青贮中霉菌和酵母菌的生长，延长有氧稳定性。多项研究数据显示，编辑后菌株的酸化速率比野生型提高15%至30%，青贮保存期延长5至10天不等。
然而，论文也指出当前研究尚存在明显局限。乳酸菌转化效率低、CRISPR-Cas9对其基因组编辑的脱靶效应、以及Cas9蛋白对宿主细胞可能产生的毒性，仍是制约技术规模化应用的关键因素。多数编辑研究停留在实验室发酵水平，尚未在真实青贮体系中开展大规模验证。此外，不同乳酸菌菌株之间的遗传屏障和限制修饰系统差异，导致通用编辑工具的普适性不足。
讨论与展望
该综述为CRISPR-Cas9在青贮乳酸菌改良中的应用绘制了清晰蓝图，但也揭示出从实验室走向产业化的巨大鸿沟。编辑效率与编辑精准度之间的平衡，安全性评估体系的建立，以及编辑菌株在复杂青贮微生物群落中的生态适应性，都是未来需要深入研究的核心问题。
随着合成生物学的快速发展，CRISPR-Cas9将不仅仅是一个基因敲除工具，更可成为构建人工合成乳酸菌底盘细胞的基石。通过整合多基因调控网络，有望设计出具备快速产酸、高效降解纤维、广谱抑菌及高胁迫耐受性的“超级青贮菌”。同时，碱基编辑和引导编辑技术的成熟将减少双链断裂带来的毒性，提升编辑存活率；而CRISPRa/i技术则能动态调控基因表达，使菌株代谢更适应青贮环境变化。
未来研究还应重视编辑菌株的生物安全评价，包括菌株在动物消化道中的存留、基因水平转移风险及环境影响。此外，开发无需抗生素筛选标记、无外源DNA残留的编辑体系，将是实现商业化应用的必要条件。该综述强调，将CRISPR-Cas9与系统生物学、合成生物学和发酵工程深度融合，有望推动青贮微生物制剂的精准化、定制化发展，为反刍动物高效养殖和可持续农业提供有力支撑。
参考来源
Ma J, Zhang J, Guo X. Harnessing CRISPR-Cas9 for Lactobacillus improvement in silage production: current knowledge and future perspectives. Journal of Animal Science and Biotechnology. DOI: 10.1186/s40104-024-01000-0.