来源：Physiol Rep | 编译：DNA Lab Space
导语
骨骼肌微血管网络是维持肌肉稳态与运动响应的核心界面，但其内皮细胞群体的分子蓝图长期未被充分描绘。Charter与Murrant首次在《Physiological Reports》上系统比较了雌性和雄性小鼠骨骼肌毛细血管内皮细胞的转录组异质性，揭示了性别特异性亚群及其功能分化的基因特征。该工作不仅重构了微血管内皮的高分辨率细胞图谱，也为性别差异化血管生物学及合成生物学工程化血管设计提供了关键的分子底座。
研究背景
毛细血管内皮细胞（Capillary Endothelial Cells, capECs）以往常被视为均一的被动屏障，然而单细胞组学技术的兴起不断刷新这一认知。在脑、肺、肾等多种组织中，capECs已被证明包含具有不同分子标记和功能取向的亚群，但在骨骼肌这一高度动态且代谢活跃的器官中，其异质性图谱和性别维度的差异仍属空白。骨骼肌占体重的40%左右，其毛细血管网络不仅负责氧气与物质交换，还深度参与肌纤维类型维持、卫星细胞稳态、炎症调节和糖脂代谢。临床上，外周动脉疾病、糖尿病微血管并发症及肌少症均存在显著的性别偏倚，提示微血管内皮的性别二态性可能是其中的关键环节。然而，以往多数血管生物学研究仅使用雄性动物或混合性别，导致潜在的雌性特异性机制被掩盖。为此，Charter等利用单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术，直接比较了健康成年雄性和雌性小鼠后肢骨骼肌中capECs的转录组全景，旨在回答以下核心问题：骨骼肌毛细血管内皮细胞是否由功能不同的亚群构成，这些亚群在两性间是否保守或存在偏移，以及差异基因可能涉及的生物学通路。
研究方法
该研究选取性成熟且同龄的C57BL/6J雌雄小鼠各6只，在标准化环境适应后，于静息状态下采集腓肠肌和跖肌复合肌群。为避免酶消化对表面抗原和转录本的干扰，组织经温和机械剪碎并采用优化的胶原酶Ⅱ/中性蛋白酶联合解离体系，结合CD45⁻/CD31⁺磁珠分选富集内皮细胞。死细胞和双细胞通过严格门控去除，单细胞悬液经10x Genomics Chromium平台构建测序文库，在Illumina NovaSeq上进行深度测序，每个细胞平均捕获约50 000 reads。原始数据经Cell Ranger处理，并使用Seurat v4进行下游分析。质量控制过滤掉基因数<200或>6000以及线粒体比例>20%的细胞。对整合后的数据集进行主成分分析、均匀流形近似投影（UMAP）降维和图聚类。通过已知标志物鉴定内皮细胞谱系，重点提取Pecam1⁺Cdh5⁺的capECs亚群做进一步亚聚类。亚群注释采用无监督聚类结合已知血管床分区基因（如动脉Gja5、静脉Nr2f2、毛细血管Rgcc和Aplnr等）以及骨骼肌特异性标志物。差异表达基因分析分别在全群和各亚群进行了雌雄对比，截取|log2FC|>0.25且调整P值<0.05作为差异基因集。后续利用基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，并通过基因集变异分析（GSVA）评估通路活性。为验证测序发现，选取Cd36、Fabp4、Sparcl1等差异基因，在独立样本中进行RNAscope原位杂交和免疫荧光共染色，并引入凝集素灌注标记功能性毛细血管，确保空间定位准确。
研究结果
在质控后共获得11 483个高质量内皮细胞，降维聚类识别出动脉、静脉、毛细血管及淋巴内皮等主要大类。其中capECs被进一步剖分为四个可重复的分子亚群：capEC-1高表达参与脂肪酸转运和氧感应的基因（如Cd36、Fabp4、Hif1a）；capEC-2富集血管生成和重塑标志物（Apln、Kdr、Esm1）；capEC-3呈现显著免疫调节表型，高表达主要组织相容性复合体Ⅱ类基因（H2-Ab1、Cd74）及趋化因子（Ccl2、Cxcl12）；capEC-4则具备周细胞样特征，上调基底膜成分（Col4a1、Lamc1）和Notch信号分子。雌雄比较展现出惊人差异：雌性小鼠骨骼肌中capEC-2亚群比例较雄性高出约17%，且该亚群中血管生成相关通路的GSVA评分显著上升，同时静息状态下的内皮细胞增殖标记Mki67亦微弱上调；相反，雄性样本中capEC-3免疫调控亚群扩大，并伴随更强的氧化应激反应和炎症信号富集，如NF-κB和肿瘤坏死因子（TNF）信号通路活化。整体转录组层面上，雌性capECs上调基因集中于“血管生成调控”“脂肪酸代谢”“雌激素响应”节点，而雄性上调基因主要关联“细胞黏附连接重构”“活性氧代谢过程”和“固有免疫应答”。值得注意的是，转录因子结合基序分析预测，雌性高活性基序为ESR1（雌激素受体α）和PPARG，而雄性则为REL和NFKB1，暗示性激素轴与性别差异表现密切相关。空间验证实验证实，Cd36在雌性骨骼肌毛细血管壁上的荧光强度显著高于雄性，且主要定位在肌内膜内的连续型毛细血管上；而免疫相关蛋白CD74在雄性微血管内皮呈斑片状高表达，与scRNA-seq结果一致。凝集素灌注排除血流差异影响，表明这些分子异质性内禀于内皮细胞本身。进一步细胞间通讯分析揭示，雄性capECs可能更多参与单核细胞招募，而雌性capECs强化与骨骼肌卫星细胞和纤维脂肪前体细胞的交互，提示两性微环境对话策略的截然不同。
讨论展望
该研究首次为骨骼肌毛细血管内皮细胞建立了性别分层的单细胞转录组图谱，颠覆了“静息态微血管内皮单一均质”的旧观念。血管生成倾向亚群在雌性肌肉中的富集，或可解释雌性个体在缺血后血管新生和运动适应性血管重塑中的优势表现，也为女性较低的外周动脉疾病截肢率提供了机制暗示。而雄性capECs突出的免疫活化状态，可能使男性骨骼肌在急性损伤或慢性低度炎症中更易陷入微血管功能障碍，如胰岛素抵抗相关的毛细血管稀疏。这一性别二态性的发现对合成生物学领域尤其具有启示价值。目前，利用诱导多能干细胞和直接重编程技术构建工程化血管类器官或组织芯片时，极少考虑性别因素。未来可根据雌雄特异性基因回路设计定制化的“性别响应”内皮细胞，例如将ESR1/Pparg协同激活的血管生成模块整合入合成生物学线路中，用于治疗缺血性疾病的女性特异性细胞疗法。此外，雄性免疫亚群上调的CXCL12/CXCR4轴可能被人工改造为抗炎输送的靶向接口。本研究也存在一定局限：仅使用单一遗传背景小鼠，尚未在动态干预（如运动、缺氧）下重新描摹亚群变化；scRNA-seq丢失了细胞空间拓扑信息，后续空间转录组学可明确capEC亚群是否沿微血管树呈现分带分布；未直接操纵性激素以证实因果性。尽管如此，该工作为性别精准的血管生物学奠定了基础，鼓舞从“男女共用”的微血管模型向性别响应性工程血管的转型。
参考来源
Charter ME, Murrant CL. Capillary endothelial cell heterogeneity in skeletal muscle of female and male mice. *Physiological Reports*, 2023; 未分配DOI. （文中数据与方法细节均基于该原文）