来源：Nucleic Acids Res | 编译：DNA Lab Space
将光遗传学与CRISPR/Cas系统相结合，是当前实现基因表达时空精准操控的重要前沿方向。近期发表于《核酸研究》的一项工作，在酿酒酵母中构建了基于光敏CRISPR/Cas的多级转录调控模块，通过不同波长的光照实现对基因转录的激活、抑制与可逆切换，为合成生物学中复杂基因线路的动态控制提供了新策略。
研究背景
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为模式真核生物和工业底盘，其基因转录的精准调控是合成生物学研究的基础。传统的转录调控工具如诱导型启动子（Gal、Tet等）依赖化学诱导剂，存在响应慢、泄漏表达高、难以空间控制等问题。CRISPR/Cas9系统的出现使得基因组编辑和转录调控变得更加灵活，特别是核酸酶失活的dCas9可融合转录抑制或激活结构域，实现对内源基因的干扰（CRISPRi）或激活（CRISPRa）。然而，这类系统通常处于持续工作状态，缺乏时间上的动态可控性和空间上的精确性。
光遗传学技术利用光敏感蛋白响应特定波长光照，可在毫秒至分钟级内实现蛋白活性或蛋白-蛋白相互作用的可逆调控。将光遗传模块整合到CRISPR系统中，有望实现非侵入性、可逆、时空高分辨的基因转录控制。但已有光敏CRISPR系统大多只针对单一调控模式（仅激活或仅抑制），且调控层次较为单一，难以满足复杂多基因调控网络的需求。因此，开发一种能够同时实现多级、可逆、精准转录调控的光敏CRISPR系统，是合成生物学领域迫切需要解决的问题。
研究方法
该研究以酿酒酵母为宿主，设计并构建了多层光敏CRISPR转录调控平台。研究人员将光敏蛋白异源二聚化对——拟南芥隐花色素CRY2及其相互作用因子CIB1——与dCas9及转录效应器融合，形成光控模块。具体而言，研究者构建了两种核心元件：一是光敏CRISPR干扰模块（简称L-CRISPRi），将dCas9与转录抑制结构域（如Mxi1或Tup1）通过光敏蛋白连接，在蓝光照射下，CRY2与CIB1结合形成完整复合物，从而将抑制结构域招募至靶基因启动子区域；二是光敏CRISPR激活模块（简称L-CRISPRa），将多个转录激活结构域（如VP64和Gal11P）与光敏蛋白融合，通过光照诱导其向dCas9结合位点聚集，强化靶基因转录。
为了实现对转录的多级精准调控，研究者进一步引入了可编程的sgRNA阵列设计。通过在单个或多重sgRNA骨架中嵌入不同识别序列，系统可同时靶向多个启动子区域，从而对不同基因施加抑制或激活。同时，研究者还构建了光强响应梯度模块，利用不同光照强度调节光敏蛋白二聚化程度，使靶基因的表达水平在一定范围内连续变化。此外，系统还引入了降解标签（如degron）和核定位信号优化，确保非光照状态下各元件快速解离或降解，降低泄漏表达。
在实验流程上，研究者首先通过荧光报告基因（如mCherry和GFP）测定各模块的光响应动态范围和泄漏水平；随后利用定量反转录PCR和RNA测序评估内源基因的转录变化；最后通过流式细胞术和单细胞荧光成像，验证系统在单细胞水平上的均一性和可逆性。实验光照系统采用470 nm蓝光LED阵列，光照强度和时间由可编程控制器调节，全程在微流控培养装置中进行，以保证光照条件的精确可控。
研究结果
研究结果显示，所构建的光敏CRISPRi系统在蓝光照射30分钟内即可显著抑制靶基因表达，抑制效率达到约85%，而非光照条件下的泄漏表达低于背景水平的2%。通过调节光照强度（5~50 μmol·m⁻²·s⁻¹），靶基因的表达水平可在10%~90%范围内连续调节，呈现出良好的剂量-响应关系。当系统转换至暗处后，靶基因表达在1小时内恢复至原始水平，可逆循环实验表明该系统可重复运行至少10个光-暗周期而活性无明显衰减。
对于光敏CRISPRa系统，研究者将多个激活结构域通过光敏蛋白串联，在光照条件下对低表达启动子的激活倍率可达到120倍，且未观察到显著的细胞毒性。进一步研究发现，将CRISPRi和CRISPRa模块同时整合于同一细胞中，通过不同sgRNA指向不同基因，可以实现单蓝光条件下对一组基因的抑制和对另一组基因的激活，从而完成转录的多级同步调控。
为验证系统对复杂基因线路的调控能力，研究者在酿酒酵母中重构了出芽酵母的代谢通量调节模块。通过光控上调脂肪酸合成关键酶基因和下调竞争性途径基因，工程菌的脂质产量在光照培养条件下比黑暗组提高了约3.1倍。RNA测序分析显示，全基因组转录组中仅少数非靶基因受到影响，表明该系统具有较高的靶向特异性。单细胞荧光成像结果表明，光照诱导下各细胞荧光强度的变异系数小于15%，说明系统在群体水平上具有出色的均一性。
讨论与展望
该研究在酿酒酵母中实现了基于光敏CRISPR/Cas的多级转录精准调控，创新点在于将光遗传学的可逆性与CRISPR系统的靶向通用性相结合，构建出既能抑制又能激活单基因或多基因的一体化平台。相比传统化学诱导系统，该系统具有响应快速、可逆、可空间编码等突出优势，并且多级调控能力使其能够模拟天然基因调控网络中复杂的动态逻辑。这为代谢工程优化、基因回路构建以及发育调控研究提供了有力工具。
然而，当前系统仍需依赖特定波长的蓝光，组织穿透性差，难以应用于深层培养；且光敏蛋白的光毒性和长时间光照对酵母生理状态的影响需进一步评估。未来工作可能的方向包括开发远红光或近红外响应系统以提升穿透性，结合机器学习算法优化sgRNA和光敏模块的配置，并将该平台推广至其他真核微生物和哺乳动物细胞。总的来说，本研究为光控基因转录调节领域提供了设计原则和可行方案，具有重要的转化与应用前景。
参考来源
Liang Y, Qi X, Gao S, Wang Y, Kan G. Multi-level precise regulation of gene transcription in the yeast Saccharomyces cerevisiae based on light-sensitive CRISPR/Cas systems. Nucleic Acids Res, 2024. DOI: 10.1093/nar/（原文DOI未提供）.