来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导语
基因组编辑技术的持续革新正在重塑生物医学研究的格局。相较于经典的CRISPR-Cas系统，近年发现的Fanzor核酸酶家族因其结构紧凑、编辑机制独特而备受关注。然而，天然Fanzor系统的编辑效率与原间隔序列邻近基序（PAM）限制严重制约了其应用潜力。本研究发表于《自然·通讯》，研究者创新性地整合深度学习蛋白结构预测与RNA结构理性设计策略，对SpuFz1蛋白及其配套ωRNA进行了系统性工程化改造，成功开发出编辑活性显著提升、PAM限制放宽的SpuFz1变体，为新一代基因组编辑工具的开发提供了全新范式。
研究背景
基因组编辑技术已从早期的锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）发展到以CRISPR-Cas系统为主导的第三代技术，实现了从“切割DNA”到“精准改写基因组”的跨越。然而，CRISPR-Cas系统存在分子量较大、在部分细胞类型中递送困难、Off-target效应以及免疫原性等问题，促使科学家持续探索结构更紧凑、功能更多样的新型核酸酶。
Fanzor蛋白是近年发现的RNA引导性核酸酶，属于OMEGA（Obligate Mobile Element Guided Activity）系统家族成员，广泛存在于真核生物基因组中。与CRISPR-Cas9（约160 kDa）和Cas12a（约130-150 kDa）相比，Fanzor蛋白分子量往往低于80 kDa，具有天然的递送优势。此外，Fanzor系统的引导RNA（ωRNA）结构域比CRISPR系统的sgRNA更为精简，有利于多功能RNA元件的融合设计。但值得注意的是，天然Fanzor蛋白的体内编辑效率普遍偏低（通常不足CRISPR-Cas9的十分之一），且对PAM序列有严格偏好性，这些瓶颈严重阻碍了其向实用化工具的转化。
近年来，深度学习驱动的蛋白质结构预测技术（如AlphaFold2、RoseTTAFold）取得了里程碑式进展，使得研究者能够在原子精度水平上预测蛋白三维结构并指导功能改造。与此同时，RNA结构预测与合理设计策略也日臻成熟，为优化引导RNA的结构稳定性和功能域排布提供了强有力的工具。如何将深度学习方法与RNA工程策略协同应用于Fanzor系统的全面优化，成为合成生物学领域备受关注的前沿问题。
研究方法
本研究采用了“蛋白工程+RNA工程”双轨并行的系统化改造策略，技术路线可分为四个主要阶段。
在蛋白质工程层面，研究者首先利用AlphaFold2对SpuFz1蛋白进行了高精度三维结构预测，获得了包含RuvC催化结构域、REC结构域以及C端结构域在内的完整结构模型。基于结构信息，研究者鉴定出多个可能影响DNA识别和切割活性的关键氨基酸残基，构建了包含120余个单点突变体的饱和突变文库。这些突变体通过大肠杆菌异源表达系统进行功能性筛选，以靶向质粒DNA的切割效率作为评价指标。
在RNA工程层面，研究者对天然ωRNA进行了系统的结构域解剖和功能分析。通过渐进截短实验，确定了维持SpuFz1-DNA识别所必需的核心结构域，同时鉴定出可删除或替换的非必需序列区域。在此基础上，研究者设计了多种小型化ωRNA变体，包括删除茎环结构、替换环区序列以及缩短间隔区长度等策略。所有ωRNA变体均通过体外转录方式制备，并与SpuFz1蛋白组装为核糖核蛋白复合物进行活性验证。
深度学习引导的蛋白工程是本研究的技术核心。研究者将AlphaFold2预测的结构信息与SpuFz1同源蛋白的多序列比对数据相结合，采用一种基于图神经网络的自监督学习方法对突变体进行了功能预测预筛。该模型以蛋白结构特征和进化保守性作为输入特征，以实验测定的切割活性作为标签进行训练。预测得分较高的候选突变体被优先合成和实验验证，实现了“计算预测-实验验证-模型迭代”的闭环优化流程。
此外，研究者还应用了PAM鉴定和特异性分析技术。通过PAM富集文库筛选方法，对SpuFz1野生型和关键突变体的PAM偏好性进行了系统性比较。对于优化后的SpuFz1变体，进一步在人类HEK293T细胞中评估了其内源基因编辑效率与特异性，采用targeted deep sequencing进行编辑效率定量，并通过GUIDE-seq方法评估全基因组范围内的脱靶效应。
研究结果
研究揭示了一个重要发现：SpuFz1蛋白与ωRNA复合物的结构模型显示，RuvC催化结构域的三维构象与其他OMEGA系统核酸酶高度相似，但REC结构域存在一段独特的插入序列（命名为RI结构域），该结构域与ωRNA的3‘端区域形成特异性相互作用。计算机模拟分析提示，RI结构域可能通过构象变化调控DNA底物的结合和释放。
通过深度学习模型引导的筛选，研究者获得了多个位于DNA结合通道周围的氨基酸突变位点，这些位点根据序列保守性预测不参与催化反应。其中，R207A和K340A两个突变显著改变了蛋白对DNA底物的亲和力，而N436S突变则被认为可增强蛋白-核酸界面的稳定性。体内外实验验证显示，将这三个突变组合形成的SpuFz1-3M变体，在多个靶位点的编辑效率较野生型提升了14至28倍，达到甚至超过了SpCas9在对应靶位点的编辑水平。
RNA工程方面的结果同样令人振奋。研究确定ωRNA的5’端前导序列和3‘端调控序列之间存在一段长度约40 nt的可变间隔区，该区域对核酸酶活性并非必需。删除此间隔区后，ωRNA的长度从204 nt缩减至164 nt，且并未显著降低编辑效率。更值得注意的是，进一步的茎环结构优化使小型化ωRNA（命名为mini-ωRNA）具备了更好的热稳定性，体外Tm值测定显示其熔解温度较野生型提高了约8°C。
PAM鉴定实验揭示了另一个关键发现：野生型SpuFz1的PAM偏好性为5‘-TTA-3’（严格偏好），而SpuFz1-3M突变体对PAM序列的容忍度显著扩展，能够在5‘-HTA-3’（H=A/C/T）以及部分NNA位点发挥编辑功能，PAM谱拓宽至原来的三倍以上。在全基因组水平上，这一PAM放宽意味着可编辑位点数量从理论上不足100万个扩展到约400万个，极大拓宽了该工具的靶向范围。
在人类细胞中的验证实验表明，SpuFz1-3M/mini-ωRNA系统在HEK293T细胞中对内源基因（AAVS1、HBB、EMX1等）实现了12.7%-41.3%的编辑效率，显著高于野生型系统（2.1%-5.4%）。GUIDE-seq分析显示，该系统在全基因组范围内的脱靶位点数与野生型相当，未因活性增强而显著升高脱靶效应，表明该变体保持了良好的编辑特异性。
讨论与展望
本研究通过深度学习引导的蛋白结构工程与RNA结构理性设计的协同优化，成功将SpuFz1的编辑效率提升了一个数量级以上，同时拓宽了PAM识别谱，实现了编辑效率、靶向范围与特异性三方面指标的整体改善。这一工作不仅提供了一种性能显著增强的Fanzor基因组编辑工具，更展示了深度学习在指导核酸酶功能进化中的巨大潜力。
研究结果揭示的RI结构域与ωRNA之间的功能偶联关系，为我们理解OMEGA系统核酸酶的RNA引导机制提供了新的结构基础。SpuFz1-3M突变位点位于DNA结合通道而非催化核心，提示其活性增强可能源于底物结合和解离动力学的优化，而非催化活性的直接改变。这一发现深化了领域内关于“核酸酶活性受底物结合动力学限制”的认识。
值得关注的是，本研究采用的“计算预测-实验验证-模型迭代”工作流程具有高度可迁移性。随着蛋白语言模型和RNA结构预测算法的不断进步，未来有望实现完全计算驱动的核酸酶设计，大幅缩短新型编辑工具的开发周期。
当前SpuFz1-3M/mini-ωRNA系统仍存在一些待优化空间：系统在分化细胞和活体动物中的编辑效率尚未充分验证；对基因治疗中常见的递送方式（如腺相关病毒载体、脂质纳米颗粒）的适用性有待评估；此外，将更多碱基编辑、引物编辑等功能模块融合进SpuFz1的compact scaffold中，是推动该系统向精准医学应用迈进的重要方向。总体而言，本研究所建立的蛋白-RNA协同进化策略，为基因组编辑工具的功能拓展提供了可复制的方法学框架，具备重要的科学价值与转化潜力。
参考来源
Chen S, Hsiao S, Xie T, Chen D, Chen N. Deep learning-guided engineering of SpuFz1 and rational miniaturization of ωRNA enables efficient genome editing. Nature Communications, 2025, 16: 1050. DOI: 10.1038/s41467-025-56192-7.