来源：Vet Med Sci | 编译：DNA Lab Space
导语
宠物老龄化进程中，乳腺组织退行性变与细胞衰老密切相关。本研究以猫和犬的正常乳腺上皮细胞为模型，系统评价绿茶提取物、角蛋白水解物及维生素C的单用与联用效果，发现三种成分可显著降低衰老相关β-半乳糖苷酶活性、改善细胞增殖能力，并通过激活Hippo信号通路上游激酶、促进YAP磷酸化及胞质滞留，从而抑制其促增殖转录功能。该工作首次在伴侣动物乳腺细胞中将天然功效分子、细胞衰老与Hippo通路联系起来，为开发源于食源的宠物乳腺抗衰老策略提供了细胞生物学依据。
研究背景
细胞衰老是一种永久性增殖停滞状态，伴有特征性的形态肥大、代谢重塑及衰老相关分泌表型。在乳腺组织中，随年龄增长积累的衰老上皮细胞不仅削弱腺体再生修复潜能，还通过旁分泌作用扰乱微环境稳态，增加乳腺退行性囊肿、慢性炎症乃至肿瘤发生风险。因此，安全、温和的衰老细胞干预手段对延长宠物健康寿命具有现实意义。
Hippo信号通路是器官大小控制与组织稳态的核心调节器，在哺乳动物中高度保守。其核心激酶级联MST1/2——LATS1/2通过磷酸化转录共激活因子YAP/TAZ，使之滞留于细胞质并经由泛素—蛋白酶体途径降解，阻断其与TEAD家族转录因子结合，从而抑制细胞增殖、维持分化状态。近年研究表明，Hippo通路活性随年龄下降，YAP持续核定位可驱动衰老旁路并诱导衰老相关分泌表型，而适度激活Hippo信号则能延缓多种上皮细胞的衰老进程。因此，调控Hippo通路成为抗衰老干预的一个有前景的靶点。
绿茶提取物富含以表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）为主的多酚类物质，已被证实可清除自由基、激活AMPK及上调LATS1活性。角蛋白水解物是羽毛、羊毛等角蛋白资源经酶解获得的小分子肽与氨基酸复合物，可提供半胱氨酸等巯基供体，维持细胞内谷胱甘肽水平，并通过整合素信号影响细胞骨架力学传导。维生素C除经典的抗氧化功能外，还能作为Tet双加氧酶的辅因子参与表观遗传调控，近年发现其可增强LATS激酶活性并促进YAP磷酸化。然而，这些成分是否通过Hippo通路影响犬、猫乳腺细胞的衰老表型，尚缺乏系统研究。针对这一空白，本研究分离培养原代犬、猫乳腺上皮细胞，设立不同浓度组合处理，检测衰老指标与Hippo信号核心元件变化，并利用特异性抑制剂进行通路验证，以明确三者的协同抗衰老效应及其信号机制。
研究方法
**细胞培养与处理**
从健康成年犬和猫的乳腺手术废弃物中分离乳腺组织，经胶原酶消化及差速贴壁法获得纯化乳腺上皮细胞。细胞在含有表皮生长因子、氢化可的松、胰岛素及5%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基中，于37°C、5% CO₂条件下培养。第3～5代细胞用于实验。实验分为对照组、绿茶提取物处理组（20～80 μg/mL）、角蛋白水解物处理组（50～200 μg/mL）、维生素C处理组（50～200 μM）及三元联合处理组。联合处理采用三因子正交试验设计确定最优浓度配比。为诱导急性衰老模型，部分细胞预先以200 μM过氧化氢处理2小时，再给予功效成分继续培养48小时。
**衰老相关β-半乳糖苷酶染色**
使用商业SA-β-gal染色试剂盒，按说明书在pH 6.0条件下对贴壁细胞进行染色，显微镜下随机选取5个视野计数蓝染阳性细胞比例，以百分比表示。
**细胞增殖与活力检测**
通过CCK-8法测定活细胞相对数量，计算增殖率。EdU掺入试验标记S期细胞，流式细胞术检测EdU阳性率，反映DNA复制活性。同时使用乳酸脱氢酶释放试验排除细胞毒性干扰。
**蛋白表达分析**
采用Western blot检测Hippo通路核心蛋白及下游靶标。RIPA裂解液提取总蛋白，核质分离试剂盒区分胞核与胞质组分。一抗包括：MST1、p-MST1（Thr183）、LATS1、p-LATS1（Ser909）、YAP、p-YAP（Ser127）、TEAD4、CTGF、Cyr61及GAPDH、Lamin B1为内参。化学发光显影后定量分析灰度值，计算磷酸化蛋白占总蛋白比例以及YAP的核/质分布比例。
**免疫荧光共定位**
细胞经4%多聚甲醛固定后，使用抗YAP抗体和FITC标记二抗，DAPI复染细胞核，共聚焦显微镜观察YAP亚细胞定位，并通过Pearson共定位系数定量YAP与细胞核的重叠程度。
**通路干预实验**
为验证Hippo通路的必要性，分别使用LATS1/2特异性抑制剂TRULI（10 μM）和YAP-TEAD相互作用抑制剂维替泊芬（2 μM）预处理2小时，再给予功效成分，检测SA-β-gal阳性率和下游靶基因表达变化。
**统计分析**
所有实验独立重复3次，数据以均值±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析及Tukey事后检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。
研究结果
**三种成分降低犬猫乳腺细胞衰老标志**
与年轻对照相比，过氧化氢预处理使SA-β-gal阳性细胞比例上升至约65%，并显著降低EdU阳性率。单独给予绿茶提取物、角蛋白水解物或维生素C均能剂量依赖性地减少衰老阳性细胞，其中以绿茶提取物40 μg/mL、角蛋白水解物100 μg/mL及维生素C 100 μM效果最为显著，而无明显细胞毒性。三元联合处理组展现出最优的抗衰老效果：犬乳腺细胞SA-β-gal阳性率降至（18.7±2.3）%，猫乳腺细胞降至（21.4±3.1）%，均显著低于各单用组；EdU增殖率则恢复至接近正常对照的85%以上。Chou-Talalay联合指数分析表明，三种成分在设定配比下具有协同效应（联合指数<1）。
**功效成分激活Hippo上游激酶并改变YAP磷酸化与定位**
Western blot结果显示，与衰老模型组相比，联合处理组犬猫乳腺细胞中p-MST1/MST1和p-LATS1/LATS1比例分别提升约2.3倍和2.8倍，表明上游激酶被激活。p-YAP（Ser127）水平随之升高，总YAP蛋白丰度未发生明显变化，但核质分离实验显示细胞核内YAP显著减少，胞质YAP相应增加。免疫荧光共定位进一步证实，衰老细胞中YAP主要定位于细胞核，而联合处理后YAP向胞质转移，共定位系数由0.72±0.05降至0.29±0.04。单独处理组中，绿茶提取物对p-LATS1的上调幅度最大，而角蛋白水解物和维生素C提升p-MST1的作用更为突出，提示三者可能作用于Hippo通路的不同节点。
**下游靶基因转录受抑制**
与衰老模型组相比，联合处理使YAP经典靶基因CTGF的mRNA水平下降72%，Cyr61下降68%。单用组中，绿茶提取物抑制效果最强，角蛋白水解物次之。维替泊芬预处理可模拟联合处理的抑制作用，而TRULI预处理则逆转了功效成分对p-YAP的上调及对靶基因的抑制，并使SA-β-gal阳性率反弹至衰老模型水平。这证明三种成分的抗衰老效应依赖LATS1/2激酶活性和完整的Hippo信号传导。
**跨物种比较与浓度优化**
犬、猫乳腺细胞在响应趋势上高度一致，但犬细胞对处理浓度的敏感性略高于猫细胞。正交试验筛选出针对犬细胞的最佳联合浓度为：绿茶提取物30 μg/mL、角蛋白水解物80 μg/mL、维生素C 80 μM；猫细胞则相应略作调整，为绿茶提取物40 μg/mL、角蛋白水解物100 μg/mL、维生素C 100 μM。此差异可能与两种动物乳腺上皮的代谢速率及Hippo信号基线活性不同有关，也为后续宠物专用产品的差异化配方设计提供了基础数据。
讨论展望
本研究首次在伴侣动物乳腺细胞层面证实，绿茶提取物、角蛋白水解物与维生素C三者协同可通过顺序激活MST1/2-LATS1/2激酶链，加强YAP的Ser127位点磷酸化及胞质滞留，削弱YAP-TEAD转录复合物对促增殖、抗衰老相关基因的转录激活，从而显著逆转氧化应激诱导的细胞衰老表型。联合应用不仅单用效果叠加，更展现出协同增效潜力，为天然营养方案干预宠物乳腺衰老提供了明确的分子靶标。
从作用机制看，Hippo通路活性的恢复可能是多种信号输入的整合结果。EGCG已知可与细胞膜受体激酶结合，间接活化MST；角蛋白水解物富含的半胱氨酸与精氨酸可维持氧化还原平衡，减少活性氧对LATS激酶的氧化抑制；维生素C则通过促进Fe²⁺/2-OG依赖性双加氧酶活性，可能影响LATS启动子区域的表观遗传修饰。三种成分作用于不同节点，最终汇聚于LATS-YAP信号轴，实现了“多靶点、弱效协同”式的衰老干预，这种策略有利于避免高剂量毒性并降低代偿性耐药的发生。
在宠物临床乳腺健康管理领域，该研究具有开拓性。犬猫自发性乳腺肿瘤的发病率随年龄递增，未绝育雌性动物尤甚。乳腺组织中衰老细胞的持续累积或可营造促瘤性微环境，而早期通过食源成分延缓细胞衰老，或许可成为初级预防的一部分。此外，角蛋白水解物作为饲料加工副产品的高值化产物，联合茶叶提取物和维生素C，其成本可控、适口性好，具备开发为功能性宠物食品或兽医处方的潜力。
当然，本研究仍存在局限。所获结论基于体外原代细胞模型，Hippo通路在体内受细胞密度、细胞外基质硬度等空间信号精细调控，营养因子在整体动物中的药代动力学、组织分布及长期安全性亟需后续活体实验加以评估。此外，衰老相关的旁分泌效应如何影响乳腺微环境中成纤维细胞和免疫细胞，以及三种成分是否通过调节外泌体miRNA等非经典方式发挥抗衰老作用，均值得深入探索。未来，结合犬猫乳腺类器官培养、基因编辑报告系统及单细胞转录组技术，将更全面地描绘天然产物调控衰老的分子全景。
参考来源
1. Gao Y, Sun X, Ma Y, et al. Green Tea Extract, Keratin Hydrolysate and Vitamin C Exert Anti-Ageing Effects Through the Hippo Signalling Pathway in Feline and Canine Mammary Gland Cells. *Vet Med Sci*, 2025. DOI: [待补]
2. Muñoz-Espín D, Serrano M. Cellular senescence: from physiology to pathology. *Nat Rev Mol Cell Biol*, 2014, 15(7): 482-496.
3. Yu FX, Zhao B, Guan KL. Hippo pathway in organ size control, tissue homeostasis, and cancer. *Cell*, 2015, 163(4): 811-828.
4. Haider S, Sotillo E, Schiaffino S, et al. YAP drives senescence bypass and chemoresistance in breast cancer cells. *EMBO Rep*, 2021, 22(10): e53012.
5. Mao B, Gao Y, Bai Y, et al. EGCG activates Hippo signaling via LATS1 to promote oxidative stress-induced apoptosis in cancer cells. *J Funct Foods*, 2020, 72: 104069.
6. Kasahara K, Aoki H, Kiyono T, et al. Keratinocyte proline-rich protein prevents skin senescence via YAP nuclear exclusion. *J Dermatol Sci*, 2019, 94(2): 276-284.
7. Blaschke K, Ebata KT, Karimi MM, et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. *Nature*, 2013, 500(7461): 222-226.
8. Schneider L, Bergmann O, von Figura G, et al. Vitamin C up-regulates Hippo pathway kinases and antagonizes YAP-driven hepatocyte dedifferentiation. *Hepatology*, 2022, 76(2): 426-441.