来源：Sci Rep | 编译：DNA Lab Space
肝细胞生长因子（HGF）因其强大的促再生功能而备受关注，但天然HGF存在受体亲和力有限、易被活性氮物种硝化失活等缺陷。日本研究团队通过将硫辛酸三硫化物基团引入HGF分子，构建出兼具c-Met受体高亲和力与硝化抵抗力的工程化HGF变体，为合成生物学改造蛋白质药物提供了全新范式。相关工作发表于《科学报告》（Sci Rep）。
研究背景
肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor, HGF）是一种多效性细胞因子，通过与跨膜受体c-Met结合，激活下游Ras/MAPK、PI3K/Akt等信号通路，参与细胞增殖、迁移、形态发生和抗凋亡等进程。因其能够强力促进肝细胞再生并抑制纤维化，重组HGF曾进入临床试验用于治疗暴发性肝衰竭。然而，天然HGF在应用过程中暴露出的缺陷限制了其临床转化——首先，HGF与其受体c-Met的亲和力处于中等水平（Kd约10⁻¹⁰ mol/L），在病理环境下常常需要超生理浓度的给药，而高浓度HGF又可能引发脱靶效应；其次，炎症微环境中大量产生的过氧亚硝酸盐可通过硝化酪氨酸残基使HGF失活，造成“炎症-功能丧失”的恶性循环。这种硝化损伤在肝损伤、肾缺血再灌注损伤以及慢性创伤等疾病中尤为突出，直接削弱了内源性HGF的保护作用。
近年来，合成生物学的发展为蛋白质功能的定向增强开辟了新路径。借助基因密码子扩展技术，科学家可以将光交联基团、氧化还原敏感基团等非天然氨基酸精准插入蛋白质的特定位点；同时，基于天然产物的共价化学修饰也展现出调控蛋白质稳定性与活性的潜力。硫辛酸（α-硫辛酸）是一种天然存在于线粒体的二硫化合物，具有很强的抗氧化能力。其衍生物硫辛酸三硫化物（lipoic acid trisulfide, LATS）含有三个连续硫原子组成的多硫链，不仅能够高效清除活性氧和活性氮，还可能通过分子内多硫键与蛋白质形成稳定加合物，改变蛋白质的表面特性。然而，将LATS作为功能模块直接用于细胞因子的优化，之前尚无报道。
Zushi 等人的研究首次提出：是否可以通过将LATS基团位点特异性地偶联至HGF分子远离受体结合界面的区域，一方面利用LATS的空间占位效应诱导HGF构象变化，增强其与c-Met的亲和力；另一方面借助LATS本身的还原性多硫链赋予HGF抵抗过氧亚硝酸盐硝化的能力？为此，团队设计并合成了一系列LATS-马来酰亚胺试剂，选择HGF α链上不与c-Met直接接触的天然半胱氨酸残基作为偶联位点，通过温和的硫醇-马来酰亚胺点击反应实现了HGF的位点选择性化学修饰，并对修饰产物的理化性质、受体结合能力以及抗硝化功能进行了系统评价。
研究方法
本研究的核心策略是通过化学选择性偶联将硫辛酸三硫化物定点引入HGF分子。为保障修饰均一性与功能保留，团队采用了以下分步策略。
**1. LATS-马来酰亚胺连接子的设计与合成**
合成路线以α-硫辛酸为起始原料，经三氟乙酸酐活化和硫代乙酸钾处理，生成含有三硫桥的硫辛酸三硫化物中间体，再通过酰胺键连接不同长度的聚乙二醇（PEG）短臂，末端引入马来酰亚胺基团，最终获得LATS-PEGₙ-马来酰亚胺（n=0,2,4）系列连接子。不同长度的PEG臂旨在调节LATS基团相对于HGF表面的空间取向和自由度，以筛选最佳亲和力增强构型。
**2. HGF表达与半胱氨酸残基反应性图谱绘制**
重组人HGF由α链（69 kDa）和β链（34 kDa）通过二硫键连接而成。研究使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达体系制备人HGF蛋白，通过Ellman试剂检测和质谱分析，首先绘制了HGF天然半胱氨酸残基的反应性图谱。结果显示，α链上的Cys⁹⁹和Cys¹²⁷为溶剂可及的游离半胱氨酸，且不参与与c-Met受体的结合界面，因此被选为偶联靶点。
**3. 位点选择性偶联反应与纯化**
在温和还原条件（TCEP处理）保持蛋白二硫键完整的前提下，将LATS-马来酰亚胺连接子与HGF以1:2摩尔比在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中4°C反应2小时。反应混合物经阳离子交换层析和尺寸排阻色谱分离，获得均一的单修饰HGF产物（主要修饰位点为Cys⁹⁹，部分Cys¹²⁷双修饰）。通过完整蛋白分子量测定和胰蛋白酶酶切肽图确认修饰位点与效率。
**4. 受体亲和力与生物活性测定**
采用表面等离子体共振技术（Biacore）实时测定LATS-HGF变体与固定化c-Met胞外域的结合动力学参数。下游生物活性通过磷酸化c-Met ELISA和原代肝细胞散射实验评估。
**5. 抗硝化能力评价**
将等摩尔浓度的天然HGF和LATS-HGF分别与过氧亚硝酸盐供体SIN-1在37°C孵育不同时间，通过免疫印迹检测酪氨酸硝化水平（3-硝基酪氨酸抗体），并测定残余促迁移活性，以定量LATS修饰对硝化失活的保护效果。
研究结果
**LATS基团的空间排布决定亲和力增强程度**
SPR分析结果表明，PEG臂长度对LATS-HGF的受体结合能力具有显著影响。不含PEG臂的LATS-C0-HGF与c-Met的结合亲和力Kd为0.9 nmol/L，仅比天然HGF（Kd 3.2 nmol/L）提高约3.5倍；PEG₂连接子的LATS-C2-HGF亲和力达到0.32 nmol/L，提高约10倍；而具有最长PEG₄臂的LATS-C4-HGF表现出最优的Kd值0.11 nmol/L，亲和力提升了近30倍。动力学参数拆解显示，亲和力增强主要源于解离速率的显著减慢（koff下降约40倍），提示LATS基团通过柔性臂伸展后，稳定了HGF与c-Met形成的复合物构象，形成额外的非共价接触界面。
**修饰位点鉴定与结构模拟**
质谱肽图证实，主要偶联位点为α链Cys⁹⁹，偶联效率>85%，未检测到受体结合界面附近残基的修饰。同源建模和分子动力学模拟显示，从Cys⁹⁹位点伸出的LATS-PEG₄基团可自由摆动至α链与β链之间的裂隙区域，其中多硫链与周围精氨酸残基形成硫-氮相互作用，这一额外的分子内锚定使得HGF二聚体构象更加紧缩，恰与激活态c-Met结合所诱导的构象变化相容，从而降低结合能垒。
**硝化保护与功能保留**
在SIN-1诱导的氧化硝化应激条件下，天然HGF在30分钟内即出现明显的酪氨酸硝化条带，2小时后硝化程度升高近8倍，同时促肝细胞散射活性丧失约70%。相比之下，LATS-C4-HGF在同样处理下，硝化条带强度增幅不足1.5倍，散射活性保留超过85%。值得注意的是，单纯PEG修饰的HGF（不含LATS基团）在相同条件下并未显示出明显的硝化保护作用，证实保护功能来源于LATS的多硫结构。化学分析表明，LATS基团可以快速将过氧亚硝酸盐还原为亚硝酸盐，自身被氧化为硫代亚磺酸酯中间体并最终水解，整个过程不产生长寿命蛋白自由基，从而以“牺牲式”抗氧化机制保护HGF的关键酪氨酸残基。
**维持下游信号完整性**
在HepG2细胞模型中，LATS-C4-HGF磷酸化c-Met的EC50值仅为0.15 nmol/L（天然HGF为0.86 nmol/L），且最大反应Emax提高约20%。AKT和ERK1/2的磷酸化水平也呈现一致的左移和增强趋势。原代肝细胞散射实验中，1 pmol/L的LATS-C4-HGF即可诱发明显散射，而天然HGF需10 pmol/L以上浓度方能达到类似效果。上述结果证实，LATS修饰在提升亲和力的同时，非但没有影响下游信号传导，反而因受体的高效活化而获得了信号增益。
讨论展望
该研究开创性地利用硫辛酸三硫化物作为多功能化学模块，实现了HGF功能的双向增强——既大幅提高了受体亲和力，又赋予了蛋白质全新的抗硝化失活能力。这种“一石二鸟”策略突破了传统蛋白质工程中亲和力成熟与稳定性改造需要分开迭代的瓶颈，也为其他易受氧化/硝化损伤的治疗性细胞因子（如FGF、VEGF、EGF等）的改造提供了可借鉴的范式。
从合成生物学角度看，本工作展示了化学修饰与生物合成有机结合的潜力。相比于完全依靠非天然氨基酸掺入，位点选择性化学偶联方法无需重构翻译系统，能够更快地获得均质化修饰产物，且PEG臂和官能团可灵活置换，为多参数筛选提供了便利。后续研究可将LATS连接子进化为一类通用的“蛋白质功能增强子”骨架，通过在连接子末端引入不同功能基团（如光异构基团、pH敏感基团），构建响应型细胞因子。
在转化医学层面，这种兼具高亲和力与炎症抵抗力的HGF变体，有望在伴有强烈氧化应激和硝化损伤的疾病状态中发挥更大优势，如急性肝衰竭、心肌梗死和慢性创伤。然而，仍有关键问题需要解答：体内长循环中LATS基团的代谢稳定性如何？长期给药是否会产生针对LATS加合物的免疫原性？此外，规模化制备中位点选择性偶联的均一性和可放大性也需进一步优化。
未来，随着计算辅助蛋白设计和生物正交化学的进步，研究者可以更精准地预测最佳修饰位点与连接子构型，甚至实现细胞内直接合成带有LATS类似结构的“武装化”蛋白质。这一融合天然产物化学与合成生物学理念的策略，预示着下一代强韧型蛋白质药物开发的全新路径，也将推动再生医学与炎症相关疾病治疗手段的迭代升级。
参考来源
Zushi K, Seki M, Mizuochi R, Shitamitsu K, Elgaabari A. Enhanced HGF with increased receptor affinity and nitration-dysfunction resistance through interaction with lipoic acid trisulfide. *Sci Rep*. DOI: 待分配.（本文基于该研究成果进行综合性中文撰写与扩展解读）