来源：Synth Syst Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导语
熊果酸是一种具有广泛药理活性的五环三萜类化合物，在抗肿瘤、抗炎、保肝等领域应用前景广阔，但传统植物提取法受限于原料供应和低产率，难以满足日益增长的市场需求。近日，江南大学周景文团队在《Synthetic and Systems Biotechnology》期刊发表研究，通过系统的酶筛选与辅因子工程策略，在解脂耶氏酵母中实现了熊果酸的高效异源合成，为三萜类化合物的微生物细胞工厂构建提供了全新思路。
研究背景
熊果酸（Ursolic Acid, UA）是一种天然存在的五环三萜化合物，广泛分布于苹果皮、迷迭香、夏枯草等药用植物中。现代药理学研究表明，熊果酸具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保肝护肝、降血糖等多种生物活性，在化妆品、功能性食品和医药领域具有巨大的应用价值。然而，传统熊果酸生产主要依赖植物溶剂提取，不仅受限于植物生长周期长、含量低等因素，而且有机溶剂的大量使用也带来严重的环境问题。
合成生物学的迅速发展为天然产物的获取提供了全新范式。通过将植物来源的生物合成途径异源重构到微生物底盘细胞中，可实现目标化合物的绿色可持续生产。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为一种公认安全（GRAS）的非传统酵母，具有强大的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A供应能力——这两者恰是三萜类化合物生物合成的核心前体，因此被认为是构建三萜细胞工厂的理想底盘。
尽管已有研究尝试在解脂耶氏酵母中合成熊果酸，但产量普遍较低，远未达到工业化生产的要求。瓶颈主要集中在三个方面：一是植物来源的氧化鲨烯环化酶（OSC）在酵母中表达效率低；二是CYP450酶及其还原伴侣蛋白的适配性差；三是辅因子供应不平衡导致氧化还原力不足。因此，如何系统性地筛选和改造关键酶元件，并优化辅因子供应网络，成为突破熊果酸高效合成的关键科学问题。
研究方法
该研究采用了“酶元件筛选—蛋白工程改造—辅因子工程优化”三步走的技术路线，系统构建了熊果酸高效合成的解脂耶氏酵母细胞工厂。
关键酶元件筛选：研究人员首先从不同植物来源中筛选了多个参与熊果酸生物合成的关键酶基因。熊果酸生物合成路径包括：法尼基焦磷酸（FPP）→ 鲨烯 → 2,3-氧化鲨烯 → α-香树脂醇 → 熊果酸。其中，α-香树脂醇合酶（α-AS）催化2,3-氧化鲨烯环化形成α-香树脂醇，是熊果酸骨架形成的关键限速酶；而CYP716A家族酶则负责在α-香树脂醇的C-28位引入羧基，将其转化为熊果酸。研究团队比较了来自不同植物的多种α-AS和CYP716A酶，通过异源表达和酶活测定确定了催化效率最高的组合。
蛋白工程改造：针对筛选出的关键酶，研究人员运用蛋白质工程手段进行定向改造。通过同源建模和分子对接分析，识别影响底物识别和催化活性的关键氨基酸残基，采用定点突变策略提升酶的催化活性和底物特异性。同时，为了提高CYP716A酶在酵母内质网上的锚定效率和与NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR）的电子传递效率，研究团队还对酶的N端跨膜结构域进行了替换和优化。
辅因子工程：CYP450酶催化的羟基化反应依赖NADPH提供还原力，因此胞内NADPH的供应水平直接决定熊果酸合成的效率。研究团队系统分析了解脂耶氏酵母胞内氧化还原代谢网络，通过过表达NADPH再生途径的关键酶——如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Zwf1）和NADP⁺依赖性异柠檬酸脱氢酶（Idp1），增强磷酸戊糖途径（PPP）和TCA循环的NADPH供给能力。
代谢通路平衡与发酵优化：此外，研究还通过在基因组上多拷贝整合关键生物合成基因，强化MVA途径碳通量流向三萜合成方向。最终在5 L发酵罐中进行补料分批发酵，验证工程菌株的生产性能。
研究结果
通过系统的酶筛选与工程改造，研究团队成功构建了高效合成熊果酸的解脂耶氏酵母工程菌株。
在酶筛选阶段，研究人员发现来源于迷迭香（Rosmarinus officinalis）的α-AS酶（RoAS）与来源于苹果（Malus domestica）的CYP716A酶（MdCYP716A）组合表现出最佳的催化效率，其熊果酸产量显著高于其他酶组合。蛋白工程改造进一步提升了关键酶的催化性能：经过定点突变的α-AS变体活性较野生型提高了约2.3倍，而经N端跨膜域优化的CYP716A变体与CPR的电子传递效率显著改善。
辅因子工程的效果尤为显著。过表达Zwf1和Idp1后，胞内NADPH/NADP⁺比值较原始菌株提高了约1.8倍，熊果酸产量在摇瓶水平达到425.6 mg/L。进一步的代谢通量平衡策略——包括强化MVA途径关键酶表达和三萜前体供应模块的拷贝数优化，使产量进一步提升至1.02 g/L。值得注意的是，研究还发现过量积累的α-香树脂醇会反馈抑制MVA途径的活性，因此对α-AS的表达水平进行了精细调控，避免了中间产物的过度积累。
在5 L发酵罐的补料分批发酵中，工程菌株最终熊果酸产量达到2.63 g/L，产率为0.036 g/(L·h)，是目前报道的解脂耶氏酵母中熊果酸合成的最高水平之一。代谢物分析显示，工程菌株中鲨烯、2,3-氧化鲨烯等中间代谢物浓度维持在较低水平，表明碳通量已高效流向目标产物。
讨论与展望
该研究通过“酶元件筛选—蛋白改造—辅因子工程”的系统策略，在解脂耶氏酵母中实现了熊果酸的高效合成，充分展示了系统代谢工程在天然产物微生物制造中的巨大潜力。研究的亮点在于：一方面，通过跨物种筛选确定了最优酶组合，并利用蛋白工程突破了异源酶在酵母中的催化瓶颈；另一方面，创新性地将辅因子工程与产物合成途径优化相耦合，解决了CYP450酶催化过程中还原力供应不足这一普遍性难题。
这一研究为其他三萜类化合物（如齐墩果酸、桦木酸等）的高效合成提供了可借鉴的技术范式。值得注意的是，当前工程菌株的产量距离工业化应用仍有差距。未来可进一步探索：利用CRISPR/Cas9技术进行多位点基因组整合以增强途径基因的遗传稳定性；通过动态调控策略平衡细胞生长与产物合成之间的关系；以及系统优化发酵工艺，包括碳源配比、诱导条件和提取工艺等。此外，将本研究建立的酶筛选与辅因子工程策略拓展至其他底盘微生物，有望推动更多高价值植物天然产物的微生物异源合成走向产业化应用。
参考来源
Elsharawy H, He Q, Zeng W, Zhou J. Systematic enzyme and cofactor engineering for efficient ursolic acid biosynthesis in Yarrowia lipolytica. Synthetic and Systems Biotechnology, 2025. DOI: 待补充.