来源：Front Bioeng Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最具侵袭性的恶性肿瘤，传统治疗手段疗效有限，CAR-T细胞疗法虽前景广阔，却长期受制于肿瘤异质性及靶点匮乏的瓶颈。本研究通过对天然氯毒素进行定向进化，获得对肿瘤表面基质金属蛋白酶-2（MMP-2）具有高亲和力和高特异性的变体分子，将其作为CAR-T细胞的靶向识别模块，在体外胶质母细胞瘤模型体系中显著增强了CAR-T细胞的杀伤活性，为实体瘤免疫治疗提供了新的靶向设计思路。
研究背景
胶质母细胞瘤是成人最常见的原发性脑恶性肿瘤，具有高度浸润性生长和极易复发的特点。现有标准治疗方案——手术切除联合替莫唑胺化疗及放疗——虽能暂时控制病情，但患者中位生存期仍不足两年。近年来，以嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）为代表的过继免疫疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了革命性突破，但将其应用于实体瘤时，却面临肿瘤异质性、免疫抑制微环境以及缺乏理想表面靶点等多重障碍。理想的CAR-T靶点需要在肿瘤细胞表面高表达，而在正常组织中低表达或不表达，且靶点分子需要具备稳定的膜结合形式以便被CAR识别。基质金属蛋白酶-2（MMP-2）是胶质母细胞瘤细胞表面高表达的一种锌依赖性内肽酶，不仅参与降解细胞外基质以促进肿瘤侵袭，还与肿瘤血管生成和免疫逃逸密切相关，因而被认为是胶质母细胞瘤免疫治疗的潜在靶点。然而，直接以MMP-2为靶点设计抗体或CAR分子存在诸多困难，包括其构象动态变化、酶活性位点与蛋白-蛋白相互作用界面的重叠，以及缺乏天然高亲和力配体等。氯毒素是一种来源于以色列金蝎毒液的小分子多肽，能够特异性地结合胶质瘤细胞表面高表达的MMP-2，但对天然氯毒素的亲和力不足以支撑高效的CAR-T细胞激活，且其自身的神经毒性也限制了直接应用。如何在保留氯毒素靶向特异性的前提下提高其亲和力，成为将这一天然分子转化为CAR-T靶向模块的关键问题。
研究方法
研究人员采用定向进化策略，以天然氯毒素为母体分子，通过系统的突变文库构建和多轮筛选，获得高亲和力MMP-2结合变体。首先，研究者合成氯毒素编码基因，利用易错PCR和定点饱和突变相结合的方式构建突变文库，将突变库克隆至酵母表面展示载体中，使每个酵母细胞表面表达一种氯毒素突变体，从而将基因型与表型在单细胞水平上偶联起来。随后，以重组人MMP-2蛋白为分选探针，结合流式细胞术进行多轮高通量筛选。每轮筛选中，研究者逐步降低靶蛋白浓度并提高洗涤严格度，以富集结合能力更强的突变体。经过数轮富集后，对阳性克隆进行基因测序解析，比对突变位点分布，并对富集到的突变体进行重组表达和纯化，利用表面等离子体共振技术和基于细胞的流式结合实验对候选变体的亲和力、结合动力学及特异性进行系统表征，最终筛选出综合性能最优的变体分子（命名为var3）。
在获得优化的MMP-2识别模块后，研究者构建了靶向MMP-2的CAR-T细胞。CAR胞外抗原识别结构域分别采用野生型氯毒素和进化变体var3，通过铰链区、跨膜区与共刺激信号域（4-1BB或CD28）及CD3ζ信号域串联，构建第二代CAR分子；以慢病毒为载体转导健康供者来源的原代人T细胞，并设未转导T细胞和野生型氯毒素CAR-T细胞为对照。体外功能验证采用多种胶质母细胞瘤细胞系（如U87、U251等）及患者来源的原代肿瘤细胞，分别在二维单层培养和三维肿瘤球模型中进行细胞毒性杀伤实验。杀伤活性通过乳酸脱氢酶释放法检测，同时收集共培养上清液，利用酶联免疫吸附法检测干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子释放水平以表征CAR-T细胞的激活程度。此外，研究者还在肿瘤球浸润模型中观察CAR-T细胞对肿瘤球结构的穿透和瓦解能力，系统评估进化型CAR-T细胞在体外胶质母细胞瘤模型中的抗肿瘤效能。
研究结果
定向进化筛选结果显示，在第二轮筛选中即观察到靶标阳性酵母群体的显著富集，经过四轮分选后，阳性细胞比例从初始文库的不足0.1%提高至50%以上。序列分析表明，富集的突变体在氯毒素分子表面与MMP-2相互作用的界面上集中出现了数个高度一致的氨基酸取代，提示这些位点对结合亲和力的提升至关重要。表面等离子体共振实验证实，最优变体var3对MMP-2蛋白的平衡解离常数相较野生型氯毒素提升了约一个数量级；流式结合实验进一步验证，var3与人胶质母细胞瘤细胞系表面的MMP-2结合信号显著强于野生型，而对照的正常星形胶质细胞结合信号保持在极低水平，说明进化过程在提高亲和力的同时并未牺牲靶点特异性。
在CAR-T功能验证方面，var3-CAR-T细胞在体外共培养体系中对U87和U251胶质母细胞瘤细胞系的杀伤效率显著优于野生型氯毒素CAR-T细胞。在较低效靶比（如1:1和1:5）条件下尤为明显，野生型CAR-T细胞的杀伤率受到明显限制，而var3-CAR-T细胞仍能保持较高的细胞毒性活性。更为重要的是，var3-CAR-T细胞在三维胶质母细胞瘤肿瘤球模型中表现出增强的浸润能力和肿瘤球瓦解效应，共培养72小时后肿瘤球完整性遭到明显破坏，而对照组肿瘤球保持相对完整。细胞因子释放检测结果显示，var3-CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后，IFN-γ和TNF-α的分泌水平较野生型CAR-T对照组显著升高，表明增强的靶点结合能力有效降低了CAR-T细胞激活的阈值，促进了T细胞的活化和效应功能。综上，这些结果为定向进化提高氯毒素对MMP-2的识别能力、进而增强CAR-T细胞抗胶质母细胞瘤活性提供了直接实验证据。
讨论与展望
本研究巧妙地利用了氯毒素这一天然靶向MMP-2的多肽分子，通过定向进化策略在保留靶点特异性的基础上显著提高了亲和力，并将其转化为功能性CAR-T胞外识别结构域，成功解决了胶质母细胞瘤CAR-T治疗中靶点亲和力不足的关键瓶颈。这一策略的核心价值在于将天然毒素分子作为可进化的识别平台，为实体瘤CAR-T靶向模块的发现提供了一条可推广的技术路径。值得注意的是，MMP-2在人体正常组织中亦有表达，因此基于该靶点的CAR-T疗法在体内的脱靶毒性需要进一步评估。此外，氯毒素作为蝎毒来源的多肽，潜在的免疫原性是向临床转化过程中不可回避的问题。未来研究可在现有基础上开展结构指导的进一步优化和人源化改造，结合双靶点CAR设计或合成生物学逻辑门控回路来提高对肿瘤组织与正常组织的辨别能力。总体而言，该研究展示了定向进化技术在肿瘤免疫治疗靶向模块开发中的巨大潜力，为以MMP-2为靶点的胶质母细胞瘤细胞免疫治疗走向临床奠定了重要基础。
参考来源
Hajdara A, Szöőr Á, Murányi J, Brunyánszki A, Rácz GZ. Directed evolution of chlorotoxin enhances MMP-2 recognition and improves CAR-T-cell activity in glioblastoma models in vitro. Front Bioeng Biotechnol. DOI: 10.3389/fbioe.2025.XXXXXX（请以期刊正式记录为准）