来源：Plants (Basel) | 编译：DNA Lab Space
导语
长春花产生的萜类吲哚生物碱是多种临床药物的来源，其中长春质碱作为抗肿瘤药物长春碱的重要前体，其生物合成受多酶协同调控。本研究在长春花毛状根中同时过表达盖苏木素合酶（Geissoschizine Synthase, GS）与长春质碱合酶（Catharanthine Synthase, CS），证实二者共表达可显著增强长春质碱的积累。该策略为通过多基因协同调控突破代谢瓶颈、提高目标生物碱产量提供了有效路径。
研究背景
长春花（Catharanthus roseus）是研究萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成的模式药用植物。其体内合成超过130种生物碱，其中长春碱和长春新碱因具有显著抗肿瘤活性而被广泛用于临床，但这些双吲哚生物碱在植物中含量极低，主要原因是其前体文多灵和长春质碱的供应不足。长春质碱本身属于单萜吲哚生物碱，既是长春碱的组成部分，又具有潜在的抗心律失常等药理活性。因此，提高长春质碱在异源或同源体系中的产量具有重要应用价值。
长春质碱的生物合成途径涉及多个亚细胞区室和至少十余种酶促反应。其中，从异胡豆苷（strictosidine）出发，经过一系列脱羧、还原、异构化等步骤生成盖苏木素（geissoschizine），继而由长春质碱合酶催化环化生成长春质碱。盖苏木素合酶催化geissoschizine生成，被认为是连接上游严格生物碱途径与下游长春质碱分支的关键节点；而长春质碱合酶则直接决定终产物长春质碱的生成效率。以往研究多采用单基因过表达策略，但由于途径中多酶协同限制，单酶增强往往难以显著提高终产物积累。因此，在毛状根中同时增强两个相邻关键酶的表达，有望更有效地推动代谢流走向目标产物。
研究方法
研究者首先从长春花cDNA中克隆了盖苏木素合酶基因GS和长春质碱合酶基因CS，分别构建至植物双元表达载体。为便于共表达，两个基因均置于强启动子（如CaMV 35S）控制之下，并通过多克隆位点策略构建含双基因表达盒的重组质粒。同时，载体携带植物选择性标记基因，用于后续转基因毛状根的筛选。
随后，采用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的遗传转化体系。将重组质粒电转化至发根农杆菌菌株中，通过叶盘法感染长春花无菌苗叶片，诱导毛状根产生。转化获得的毛状根在含适宜抗生素的固体培养基上继代培养，以去除农杆菌并获得稳定转化的根系克隆。通过PCR检测报告基因或目的基因片段，初步筛选阳性毛状根系；进一步采用qRT-PCR分析GS和CS在mRNA水平的相对表达量，筛选出高表达共转化株系。
在生化与产量分析方面，对阳性毛状根进行液体培养，测定其鲜重和干重以评估生长速率。采用高效液相色谱（HPLC）或液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量检测毛状根中长春质碱的含量。同时设立未转化毛状根（野生型）及单基因过表达株系作为对照，以比较单基因与双基因过表达对长春质碱积累的影响。每组实验设置多个生物学重复，数据经统计学分析以评估差异显著性。实验整体技术路线如下：
研究结果
转基因毛状根的分子鉴定显示，共过表达株系中GS和CS基因均整合到基因组中，qRT-PCR检测到其转录水平较野生型显著上升，表明双基因在毛状根中实现了有效转录。单基因过表达株系中仅相应靶基因转录上调，而共表达株系中两个基因的转录水平均高于野生型，且GS的表达量约为野生型的数倍，CS表达量亦有显著提升。
代谢产物分析结果显示，共表达GS和CS的毛状根中长春质碱含量显著增加。具体而言，共表达株系的长春质碱含量相较于野生型毛状根提高了约2—3倍，且高于任一单基因过表达株系的水平。这一结果表明，同时增强两个相邻酶的催化能力能够更有效地促进代谢流趋向长春质碱的合成，单纯强化单一酶仅能部分提升产量，协同上调两个关键酶具有明显的叠加效应。
在生长表型方面，共表达毛状根的生长速率与野生型相比无显著差异，说明外源基因的过表达并未对毛状根的正常生长造成明显负担，也排除了产量提高仅由生物量增加所致的可能性。结合表达量与产物含量的相关性分析，进一步证实长春质碱的积累与GS、CS的协同表达呈正相关。
此外，研究还检测了毛状根中底物或中间代谢物的变化。共表达株系中盖苏木素水平较单基因过表达株系未见异常积累，提示CS的共表达能够有效地将上游中间产物转化为长春质碱，从而减少中间产物堆积，疏通代谢途径的瓶颈环节。这些数据共同说明，GS与CS的共表达通过“上游推动+下游拉动”的协同机制，显著提升了长春质碱的生物合成效率。
讨论与展望
本研究通过在长春花毛状根中共表达盖苏木素合酶与长春质碱合酶，实现了长春质碱产量的显著提高，验证了多基因协同调控在植物次生代谢工程中的优势。传统单基因策略常受限于多步酶促反应中的多个潜在瓶颈，而共表达位于同一代谢分支且功能相邻的酶，能够更有效地平衡代谢流，减少中间产物反馈抑制或竞争分流。本研究结果也提示，GS和CS是长春质碱合成途径中的关键限速步骤，二者协同上调可能触发了从上游异胡豆苷途径到终产物合成路径的整体通量提升。
不过，目前共表达研究仍局限于毛状根培养体系，距离大规模生产应用尚有一定距离。后续工作可尝试在整株植物或悬浮细胞中验证效果，或引入更多途径酶如异胡豆苷合酶等，构建多基因级联共表达。此外，通过诱导型启动子或区室化表达进一步精细调控表达水平，以及结合代谢组和转录组分析深入解析协同调控的网络机制，将为长春花生物碱的绿色生物制造提供更可行的方案。
参考来源
Li X, Li G, Hu Z, Wang J, Chen Y. Co-Overexpression of Geissoschizine Synthase and Catharanthine Synthase Increases Catharanthine Biosynthesis in Catharanthus roseus Hairy Roots. Plants (Basel). 2023. DOI: 10.3390/plants12213658.