来源：Toxins (Basel) | 编译：DNA Lab Space
近年来，食品安全、环境监测与临床诊断领域对毒素检测的需求日益迫切，而基于核酸适配体的生物传感技术凭借其高亲和力、高特异性及易于化学修饰等优势，正逐步成为传统抗体免疫检测的有力补充。适配体通常通过指数富集的配基系统进化技术（SELEX）从随机核酸文库中筛选获得，然而传统SELEX流程耗时费力，且对毒素这类小分子靶标的筛选效率往往受限。如何在筛选源头优化文库设计、在筛选后高效提升适配体性能，并借助计算工具实现理性设计与改造，已成为该领域的研究热点。本文围绕最新发表于Toxins期刊的综述论文，系统梳理了SELEX适配体技术在毒素分析中的整体流程、优化策略及计算辅助设计的前沿进展，为相关领域研究者提供了从实验筛选到计算设计的全链条视角。
研究背景
毒素是来源于生物体或人工合成的对生物系统具有显著毒害作用的物质，其种类繁多，涵盖真菌毒素、细菌毒素、海洋生物毒素及环境污染物等。毒素暴露往往具有剂量低、潜伏期短、危害不可逆等特点，因此建立灵敏、快速、经济的检测方法对于保障食品安全和公共健康至关重要。目前常用的传统检测手段包括高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法以及酶联免疫吸附测定法等，这些方法虽然在灵敏度和准确性上表现优异，但普遍存在仪器昂贵、操作复杂、需要专业技术人员等局限，难以满足现场快速检测和大规模筛查的需求。
适配体是一段经体外筛选获得的单链DNA或RNA分子，能够通过其独特的三维结构特异性识别目标分子。与抗体相比，适配体具有分子量小、热稳定性好、批次间差异小、易于合成和修饰等突出优点。特别是对于小分子毒素，适配体能够识别其结构上的细微差异，具有极高的特异性。自1990年SELEX技术问世以来，适配体已在生物传感、药物递送和疾病诊疗等领域展现出广阔的应用前景。然而，适配体的获得并非一蹴而就，SELEX筛选的成功率很大程度上取决于文库设计、筛选策略、富集监测以及后期优化等多个环节。尤其是在面向毒素小分子时，靶标固定化方式、文库与靶标结合的洗脱条件等因素均会显著影响筛选结果。近年来，计算生物学方法的引入为适配体的筛选与优化提供了新的动力，通过预测核酸结构、模拟分子对接以及机器学习模型训练，研究者能够在减少实验工作量的同时显著提高筛选效率和成功率。
研究方法
该综述系统归纳了面向毒素分析的SELEX适配体筛选与优化的完整技术路线，并提出将计算辅助设计融入传统筛选流程的整合思路。文中首先介绍了SELEX技术的基本原理与操作流程：以人工合成的随机核酸文库为起点，文库中通常包含约10¹⁴至10¹⁵种随机序列，在特定缓冲条件下与靶标共孵育，随后通过多种方式将结合序列与非结合序列分离，经PCR扩增富集，再进入下一轮筛选。整个过程一般需要8至15轮才能获得高亲和力适配体。
针对毒素小分子靶标的特殊性，综述重点讨论了靶标固定化策略。常用的方法包括将毒素分子通过化学交联偶联到琼脂糖微球、磁珠或微孔板表面，以便于结合序列的有效分离。然而，毒素分子表面可供化学修饰的官能团往往有限，固定化过程中还可能改变毒素原有的空间构象，导致筛选出的适配体无法很好地识别游离态毒素。因此，部分研究采用全文库固定化策略，即将随机文库固定在芯片或磁珠上，加入游离毒素竞争结合，间接实现对毒素特异的适配体筛选。
优化环节中，截短和突变是提升适配体性能的两大主要手段。经过多轮筛选得到的适配体序列通常包含中心保守区及两侧引物结合区，而引物区在后续传感应用中可能干扰结构稳定性。综述指出，通过最小化结构域的截短设计，可以保留核心结合口袋而剔除冗余序列，从而降低合成成本并提高结合亲和力。同时，定点突变和化学修饰（如引入硫代磷酸酯骨架、2'-氟代嘧啶等）能够增强适配体的核酸酶抗性和结合亲和力。此外，软件预测辅助的酶切图分析技术，如利用核酸酶S1或核酸酶P1对不同结构区域进行酶切，可帮助研究者精确鉴定适配体的功能核心区域。
在计算辅助设计方面，综述详细阐述了多种生物信息学工具和分子模拟方法在适配体筛选和优化中的具体应用。RNAfold、Mfold和ViennaRNA等工具能够基于最小自由能算法预测核酸的二级结构，帮助研究者快速评估候选序列的构象稳定性。分子对接软件如AutoDock和MOE可对适配体-毒素复合物的三维结构进行模拟，预测关键结合位点和相互作用力。近年来，分子动力学模拟也被引入以考察适配体-靶标复合物在水溶液中的动态行为，揭示结合过程中的构象重排和能量变化。此外，基于机器学习的评分模型正逐步发展，通过收集已报道的适配体-靶标相互作用数据训练算法模型，实现对候选适配体的高通量虚拟筛选。
在正文中相应插入技术路线图如下：
研究结果
该综述通过对近年来适配体毒素检测领域代表性研究工作的系统归纳，呈现了多项关键发现和趋势。在毒素靶标类型方面，真菌毒素尤其是黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮等，是目前适配体筛选研究最为集中的领域，这与食品安全监控的迫切需求密切相关。细菌毒素方面，针对肉毒毒素、肠毒素和霍乱毒素的功能性适配体也已被成功筛选并应用于检测平台的搭建。海洋毒素如河豚毒素和微囊藻毒素的适配体筛选同样取得了重要进展。
在筛选效率提升方面，综述总结了多种改进策略的效果比较。例如，使用毛细管电泳SELEX可将筛选轮数从传统的十余轮缩减至2至3轮，极大地缩短了筛选周期。基于磁性微球的SELEX可以在30分钟内完成一轮筛选中的结合与分离步骤，配合qPCR技术实时监测每轮富集效率，显著提高了流程的自动化程度。此外，引入竞争洗脱策略——即用结构类似物与靶标竞争结合已固定的适配体——可有效富集对靶标具有更高特异性的适配体序列，减少交叉反应。
计算辅助设计的应用成效是综述的另一重要产出。在多个案例中，经过分子对接和动力学模拟指导的截短与点突变设计，适配体的解离常数较原始序列降低了一个数量级以上。以黄曲霉毒素B1适配体为例，通过计算模拟确定的G-四链体核心区在第3和第12位点上的碱基替换可显著增强适配体与毒素之间的π-π堆积作用，结合常数提升约5倍。类似地，对赭曲霉毒素A适配体进行的茎环结构稳定性优化，使得适配体在50%血清环境中的半衰期延长了3倍，为后续体内传感应用奠定了基础。
文章还指出，目前常用的SELEX数据库、UniProt和PDB等公共资源为计算工具的训练和验证提供了丰富的数据支撑，而WebLogo序列保守性分析能够直观展示多轮筛选后各位置碱基的偏好性，帮助研究者锁定关键结合位点。部分研究将高通量测序与生物信息学分析相结合，对SELEX各轮文库进行深度测序，大幅提升了筛选过程的监测精度，可追踪适配体的进化路径并及早筛选出高潜力候选序列。
随着计算技术的迅速发展，基于深度学习的适配体活性预测模型已在某些体系上表现出超越传统打分函数的预测精度。图神经网络被用于编码核酸序列的二级结构特征，结合实验数据训练回归模型，可在数千条候选序列中快速排序并挑选高概率有效序列，为后续实验验证提供精准的备选列表。尽管这些模型仍存在对训练数据数量和质量的依赖性问题，但已有多个研究团队正在建立标准化的适配体-靶标亲和力数据库，以推动领域的良性发展。
讨论与展望
SELEX适配体技术经过三十余年的发展，在毒素分析领域已取得长足进步，但仍有多项挑战亟待克服。首先，毒素小分子的结构差异往往十分微小，适配体对这些类似物的辨识特异性仍有待提升。例如，黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B2的差异仅为一个双键，要在筛选中获得仅识别其中之一的适配体，需要更为精细的文库设计和负筛选策略。其次，SELEX筛选成功率的可预测性仍较低，实验条件中的细微变化如离子浓度、孵育温度和洗脱强度均能左右最终结果，而经验性的试错调整在当前研究范式下仍然普遍存在。
计算辅助设计的兴起为提升筛选效率和适配体性能带来新的希望。当前，分子模拟和机器学习方法的介入已在一定程度上实现对适配体结构的理性预判和活性排序，但其预测准确性仍高度依赖实验数据的积累。未来，将自动化筛选仪器、高通量测序平台与计算算法深度融合，有望构建一个真正的“设计-合成-筛选-优化”闭环系统。此外，将适配体与纳米材料、微流控芯片和便携式传感器整合，是推进中毒素检测从实验室走向现场应用的重要路径。标准化适配体数据的收集与共享也将成为领域可持续发展的关键推动力。总体而言，SELEX结合计算辅助设计的技术路径，正在为毒素分析提供更加高效、灵敏和自动化的解决方案。
参考来源
Shang X, Yang C, Deng H, Wang L, Sun M. SELEX-Based Aptamer Technologies for Toxin Analysis: Screening, Optimization, and Computational Assisted Design. Toxins (Basel). 2025. DOI: 10.3390/toxins17050219.