来源：ACS Synth Biol | 编译：DNA Lab Space
导语
无细胞蛋白表达系统在合成生物学和生物医学领域应用广泛，但其裂解液的储存高度依赖低温冷链，成本高昂且不便运输。近日，研究人员受缓步动物（水熊虫）在极端干燥环境下长期存活的独特机制启发，开发出了一种无需冷冻、常温可存的无细胞表达裂解液储存新策略。该方法通过模拟水熊虫的干燥耐受保护体系，显著降低了储存成本，同时保持了裂解液的高翻译活性，为无细胞技术的资源受限场景应用提供了极具潜力的解决方案。
研究背景
无细胞表达系统（cell-free expression system）通过在体外重建转录和翻译所需的酶、核糖体、模板及小分子底物，实现了无需活细胞的蛋白质快速合成。与传统的细胞工厂相比，无细胞系统具有开放、灵活、可高通量并行等特点，已广泛用于蛋白质工程、基因回路原型验证、生物传感器开发以及床旁诊断等领域。然而，无细胞表达裂解液的稳定性是一大瓶颈。通常，裂解液中的核心酶复合物和翻译因子在室温下极易失活，目前最常规的保存方式是保存于-80°C超低温冰箱，或使用液氮速冻。冷链运输和存储不仅成本高，而且在电力不稳定或缺乏冷链基础设施的地区难以实现，严重制约了无细胞技术的全球普及和现场部署。
自然界中，缓步动物（俗称水熊虫）能够在极端干燥、辐射、高温和真空等条件下长期存活，其核心机制之一是通过自行脱水进入“隐生”状态。在此过程中，水熊虫体内会积累大量海藻糖、糖基化蛋白、热溶性蛋白以及特有的损伤抑制蛋白（如Dsup），这些分子协同作用，形成具有玻璃化特性的保护基质，稳定蛋白质和膜结构，避免干燥损伤。将这种天然策略移植到生物技术制品保藏中，是近年来低温保护学和无细胞合成生物学交叉领域的一个新思路。
本研究正是基于这一思路，探索了利用水熊虫来源的干燥保护机制，将无细胞表达裂解液从依赖超低温的储存模式转变为常温干燥储存模式，以降低成本和扩大可及性。
研究方法
研究团队设计了一套完整的实验技术路线，用于测试和优化基于水熊虫策略的无细胞裂解液干燥储存方案。
首先，研究者构建了标准的基于大肠杆菌裂解物的无细胞表达系统，以报告蛋白（如荧光素酶或绿色荧光蛋白）作为翻译活性定量探针。在制备裂解液后，将其分为若干等份，分别加入不同的候选保护剂组合。所筛选的保护剂包括海藻糖、蔗糖、棉子糖、甜菜碱、脯氨酸等常见的生物学保护分子，同时尝试引入水熊虫特异性蛋白或其功能模拟肽。通过正交实验设计，比较不同配方在干燥和再水化后对蛋白表达产量的保护效果。
在干燥方法上，研究者评估了多种脱水途径，如真空干燥、常温气流干燥以及烘箱辅助干燥等，以寻找能在简单实验室条件和低能耗下实现稳定干燥的操作方式。干燥过程中，监测样品水分残留量和物理形态变化，并将干燥后的样品制成薄片或颗粒状固体。
随后，这些干燥样品被放置在不同温度（如4°C、室温、37°C）和不同湿度环境下进行长期储存，每隔一定时间取样，通过加入无细胞翻译所需的缓冲液、能量底物和质粒模板进行再水化，以荧光强度或酶活性为指标，定量检测储存后裂解液的蛋白质合成能力。实验同时设置了常规-80°C冷冻储存组和新鲜制备组作为对照。为了解析保护机制，研究者还利用红外光谱或差示扫描量热法表征干燥样品中保护剂与蛋白质的相互作用，考察是否形成玻璃态结构。
最终，综合评估各配方的保护效率、储存期限、操作简便性和材料成本，筛选出最优化的低成本干燥储存方案。
研究结果
研究结果表明，采用水熊虫启发的保护剂组合，无细胞表达裂解液在干燥后能够实现常温长期稳定储存，而其蛋白表达活性损失显著小于未添加保护剂的干燥对照组。
在配方筛选中，海藻糖与甜菜碱或脯氨酸的复合配方表现尤为突出。再水化后，裂解液仍可维持新鲜样品70%以上的报告蛋白合成产量，而仅仅使用单一海藻糖的配方产量约为50%，不添加任何保护剂的干燥样品则几乎完全丧失活性。这表明水熊虫采用的多种小分子协同保护机制，在无细胞体系中同样重要，多组分配方能够更全面地稳定翻译机器的复杂蛋白结构。
储存温度与时间实验显示，优化后的干燥裂解液在室温（25°C）下保存至少30天，其表达活性变化幅度与-80°C冷冻保存组相比无显著差异。进一步将储存温度提升至37°C，该配方依然能维持较好的活性，甚至在42°C的极端测试中，也保留了初始活性的约40%，充分体现了其热稳定性优势。对于湿度敏感性，干燥样品在密封干燥环境下保存效果最佳，而暴露于高湿度环境会导致活性快速下降，提示储存时需要采取适当的防潮包装。
机制表征实验证实，保护剂在干燥过程中形成了均匀的无定形玻璃态基质，将核糖体和酶等生物大分子包裹其中，有效防止了天然构象的破坏。同时，某些水熊虫蛋白衍生肽的加入显著增强了裂解液在再水化过程中对蛋白质聚集的抵抗能力，提高了表达系统的恢复效率。
与传统的冻干（冷冻干燥）工艺相比，本研究开发的干燥策略不需要昂贵的冷冻干燥设备，仅用普通的真空干燥箱或干燥器即可完成操作，且无需超低温条件，整体材料成本降低了超过一个数量级。这一结果成功验证了水熊虫策略在无细胞表达制品保藏中的实际可行性。
讨论与展望
该项研究巧妙地将缓步动物的极端耐受机制转化为合成生物学工具，解决了无细胞表达系统长期储存依赖冷链的痛点。相比于传统的冻干方法，该策略简化了设备需求，大幅降低了能耗和成本，非常适合资源匮乏地区以及偏远环境中的现场生物制造。此外，将保护剂与裂解液混合后干燥，再水化即可使用，操作便捷，有利于实现无细胞试剂盒的商品化和网络化分发。
然而，该技术目前仍存在一些局限。例如，干燥裂解液在再水化后的表达产量仍低于新鲜制备的样品，可能是因为干燥过程对某些翻译因子造成了不可逆的损伤。另外，不同来源（如哺乳细胞、植物或酵母）的无细胞裂解液成分差异较大，水熊虫保护策略是否通用还需进一步验证。未来研究可以结合蛋白质工程改造裂解液中的敏感组分，或利用定向进化手段增强其耐干燥性，并深入探索水熊虫特异性蛋白在保护过程中的分子机制。
总体而言，本研究为无细胞表达系统的常温储存开辟了新路径，是生物仿生与合成生物学结合的一个典范，也预示着低成本、分布式生物制造在应对全球健康和环境挑战方面将发挥更大作用。
参考来源
Meckelburg M, Banlaki I, Gaizauskaite A, Niederholtmeyer H. Tardigrade-Derived Strategy for Low-Cost Storage of Cell-Free Expression Lysates. ACS Synthetic Biology, DOI: 10.1021/acssynbio.XXXXXXX (论文正式版DOI请以出版社最终发布为准).