来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导语
D-高色氨酸是合成多种手性药物的重要非天然氨基酸，传统化学法存在步骤繁琐、立体选择性差等瓶颈。近期发表于《自然·通讯》的一项研究，将微生物细胞工厂与一种自然界中不存在的光生物催化体系巧妙耦合，以葡萄糖为原料直接从头合成了D-高色氨酸。该策略通过光能驱动不对称转化，实现了高立体选择性、高收率的绿色生物合成，为手性非天然氨基酸的制造开辟了新路径。
研究背景
D-高色氨酸（D-homotryptophan）属于非蛋白氨基酸，因含有一个额外的亚甲基桥结构，在药物化学中被广泛用作构象限制骨架和手性砌块。多种正在临床研究的肽类药物、蛋白酶抑制剂及神经活性分子合成都依赖高光学纯的D-高色氨酸。然而，该化合物的不对称合成极具挑战性。传统化学路线通常需要多步反应、昂贵手性催化剂以及苛刻的无水无氧条件，且往往面临产率低、立体选择性差的问题。酶法合成虽具有天然选择性，但已有的氨基酸转氨酶或脱氢酶主要局限于天然L-构型的合成，或在需要外源添加高能底物，难以实现从廉价碳源出发的”从头合成”。
近年来，光生物催化迅速发展——通过可见光激发酶或酶-光敏剂复合物，能够驱动天然酶无法催化的新反应类型。这类”new-to-nature”光生物催化具有高原子经济性和绿色常温常压的优势，但通常只用于单元反应，缺少与上游代谢网络的整合。如何将光能驱动的非天然反应嵌入微生物全细胞合成途径，实现从糖类到目标手性化合物的端到端生产，仍是合成生物学的重大难题。本研究正是针对这一空白，设计了一台”微生物发酵+光生物转化”耦合的双模块生物合成系统，首次实现了D-高色氨酸的从头生物制造。
研究方法
研究采用“两段式模块化集成”的技术路线，分为微生物细胞工厂构建和光生物催化体系开发两个部分，最终在反应器层面实现耦合。
首先，研究者以大肠杆菌为底盘菌株，构建了高色氨酸中间体——2-氧代-4-(3-吲哚基)丁酸的生物合成途径。该途径以葡萄糖为碳源，先强化内源莽草酸途径用于色氨酸前体分支酸的高效供给；随后通过异源表达色氨酸侧链延长酶（来自链霉菌的硫解酶类酶），将L-色氨酸侧链延展一个碳单位，再经脱氨和氧化得到γ-吲哚基-α-酮丁酸。研究者通过启动子工程、核糖体结合位点优化以及关键酶的点突变，使中间体产量达到较高水平。同时敲除了竞争途径，如吲哚分解代谢和酮酸降解相关基因，以阻断副产物生成。
其次，针对D-高色氨酸的不对称合成，作者开发了一种基于光激发烯烃还原酶的新至自然催化体系。他们对来自拟南芥的经典黄素依赖烯烃还原酶进行改造，引入光氧化还原活性氨基酸残基，使该酶能够在可见光照射下直接活化2-氧代-4-(3-吲哚基)丁酸的C=O键，以铵盐作为氨源进行光驱动的还原胺化反应。定向进化获得了具有D-选择性的突变体（通过三突变Y343F/W378V/E402A），其立体选择性翻转至D型，对映体过量值可达98%以上。该催化过程以水为介质，仅需低功率蓝色LED照射，不依赖昂贵辅因子再生系统。
最终，研究者将上述光生物催化模块与大肠杆菌全细胞发酵模块进行原位整合。采用透光反应器，在发酵中后期同步引入光照射与固定的重组酶，使微生物产生的酮酸中间体被立即转化为D-高色氨酸，从而解除产物对代谢途径的反馈抑制。光催化剂以固定在磁性纳米颗粒上的形式加入，反应结束后可简单回收再利用。
研究结果
该研究实现了从葡萄糖到D-高色氨酸的完整从头合成。在最优化的发酵-光转化偶联条件下，最终D-高色氨酸摇瓶产量达到7.8 g/L，5 L生物反应器中产量进一步提升至24.6 g/L，摩尔转化率（以消耗的葡萄糖计）为11.3%，分离后总产物纯度为99.2%。关键的是，产物对映体过量（ee）值始终保持在99%以上，未检测到L-高色氨酸或其他非对映体杂质，证明了光生物催化具有卓越的立体控制能力。
作者还对催化机理进行了详细解析。通过中间体捕获和同位素标记实验证实，光驱动的还原胺化步骤经历了自由基偶联机制：光激发黄素辅因子攫取底物羰基碳的电子，形成α-氧自由基，随后与铵盐提供的氨基自由基偶联，最终生成手性胺。该机制的发现意味着该策略可扩展至其他α-酮酸，只需更换底物酶口袋匹配残基即可。
在过程优化方面，作者发现固定化光酶在连续四轮批次反应中活性保留超过85%，显示出良好的工业稳定性。同时，微生物发酵与光催化模块的分时控制也避免了细胞对光氧化损伤的敏感性——通过分步增加光强度的策略，大肠杆菌在高光强下的存活率保持在70%以上。该工艺在放大规模中表现出稳定的时空产率，使D-高色氨酸的总生产成本较化学法降低约45%。
讨论与展望
这项研究的突出价值在于，将“新至自然光生物催化”从单纯的合成工具升级为全细胞生物合成途径的组成部分。通过将光能驱动的不对称反应与微生物代谢网络相融合，突破了传统发酵仅依靠碳源代谢提供化学能的局限，为生产高能耗、高还原态的非天然手性化合物提供了全新范式。与化学合成相比，该过程以可再生葡萄糖为原料、以水为介质、以光为驱动力，显著减少了有毒溶剂和重金属污染。
不过，目前体系仍存在微型反应器光穿透深度有限、高浓度产物抑制酶活性等问题，需要进一步通过反应器光学设计和酶定向进化来解决。此外，D-高色氨酸的碳收率仍低于理论最大值，中间体酮酸向副产物方向的部分泄漏还需通过动态调控优化。但可以展望，随着光酶工程和发酵过程控制技术的进步，这种“光-生物融合”制造平台有望推广到其他高附加值非蛋白氨基酸、手性胺及天然产物衍生物的绿色合成，展现出广阔的工业应用前景。
参考来源
Guo Z, Gao G, Xiang G, Yuan X, Yu J. Integrating microbial cell factory with new-to-nature photobiocatalysis for de novo biosynthesis of D-homotryptophan. Nature Communications. DOI: 10.1038/s41467-025-00000-0 (原文DOI以正式出版为准)