来源：Rational design and synthesis of a heterocycle scaffold for DNMT3A inhibition（Bioorganic Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
DNA甲基化异常与多种癌症密切相关，而现有核苷类DNMT抑制剂存在化学不稳定性和DNA嵌入依赖性细胞毒性等缺陷。本研究以胞嘧啶药效团为核心，通过MOE骨架替换生成5287个虚拟类似物，经类药性和合成可及性过滤后锁定82个候选化合物，最终合成两个先导化合物6o和6p。两者对DNMT3A的IC50约为30 μM，而对DNMT1即使在320 μM高浓度下也仅显示微弱或无抑制活性，并在HCT116结直肠癌细胞中表现出抗增殖效果。
研究背景
DNA甲基化是一种关键的表观遗传修饰，主要由DNA甲基转移酶（DNMTs）催化。异常DNA甲基化模式——尤其是肿瘤抑制基因启动子高甲基化——可导致基因沉默并促进癌症发展。这些表观遗传改变与DNMT过表达相关。在哺乳动物中，DNMT1和DNMT3A是参与DNA甲基化的关键酶。DNMT1表达升高与肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和结直肠癌等多种癌症有关；DNMT3A过表达则见于外阴鳞状细胞癌、垂体腺瘤、急性髓系白血病、胃癌、肺癌和结直肠癌。
目前已有两种DNA甲基化抑制剂获批临床使用：地西他滨（Dacogen®）和阿扎胞苷（Vidaza®）。但这些药物存在化学不稳定性和DNA嵌入依赖性细胞毒性等局限，其毒性独立于DNMT抑制。这些不足推动了非核苷类DNMT抑制剂的研发。SGI-1027是第一代非核苷类DNMT抑制剂，常作为参考化合物使用，但其选择性有限，对DNMT1和DNMT3酶均有抑制作用。本研究聚焦于从头DNA甲基转移酶DNMT3A。
研究方法
3.1 一般方法
研究中使用的化学试剂（分析纯）购自ACROS和Sigma Aldrich。快速柱层析使用粒径40–63 μm的硅胶。分析型薄层色谱（TLC）在Merck预涂GF 254硅胶板上进行。最终化合物6o和6p经高效液相色谱（HPLC）确认纯度超过95%，分析在Shimadzu LC-20A HPLC-UV系统上使用C18反相柱进行。核磁共振（NMR）谱，包括1H和13C，在Bruker AC 300或AC 400光谱仪上记录，以DMSO-d6同时作为溶剂和内标。耦合常数（J）以Hz表示。红外（IR）光谱使用Perkin-Elmer 1600分光光度计获得。熔点在不校正的情况下使用Stuart SMP3装置测定。高分辨质谱（HRMS）分析在ICOA实验室的SALSA平台上通过Bruker maXis质谱仪进行。
【数据】试剂来源：ACROS、Sigma Aldrich；硅胶粒径：40–63 μm；HPLC纯度：>95%；NMR溶剂：DMSO-d6；熔点仪：Stuart SMP3；质谱仪：Bruker maXis
3.2 先导化合物的计算机优化
从RCSB蛋白质数据库中获取DNMT3A与S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH）结合的晶体结构（PDB编号：5YX2）。使用Chimera 1.17.3进行蛋白质准备，去除水分子和其他杂原子，并分配部分电荷。配体结构最初使用ChemDraw绘制，随后在Chem3D中生成3D模型，应用MM2能量最小化优化构象。使用AutoDockTools-1.5.7将mol2格式转换为pdbqt格式。结合口袋根据文献中鉴定的参与DNA和SAH结合的关键氨基酸残基确定。围绕5YX2 PDB结构中C链的结合位点构建了一个网格盒（24 × 20 × 22 Å）用于后续对接模拟。采用AutoDock Vina预测设计配体的结合模式，随后进行MOE模拟。在MOE中，5YX2-C链被指定为受体，AutoDock Vina排名最高的结合 pose 被选为配体。为探索新的化学骨架，应用了MOE中的骨架替换功能，结合逆合成组合分析程序（RECAP）、拓扑唯一性过滤和基于描述符的约束。描述符过滤器定义为分子量< 500 Da，TPSA在40至140之间，SlogP在−4至8之间。初始的5287个化合物在MOE中以刚性受体模型进行高通量分子对接。对接结果按Affinity dG评分函数排序，随后根据合成可行性进行精炼，优先选择单取代的简单苯环核心和最多一个手性中心。进一步过滤选择logP < 3的化合物，并通过FAF-drugs4消除不良子结构。对于排名前20的化合物，最终合成两个可及的化合物用于进一步评估。
【数据】PDB编号：5YX2；网格盒尺寸：24 × 20 × 22 Å；虚拟库规模：5287个化合物；分子量阈值：< 500 Da；TPSA范围：40–140；SlogP范围：−4至8；logP阈值：< 3；最终候选：82个化合物；合成化合物：2个
3.3 分子动力学模拟
从蛋白质数据库获取人DNMT3A的晶体结构（PDB ID：5YX2-C链）。从MOE对接结果中选择DNMT3A与6o和6p的复合物作为分子动力学（MD）模拟的初始结构。使用CHARMM-GUI服务器以150 mM KCl溶液溶剂化复合物结构。应用CHARMM36 m力场描述蛋白质和离子。能量最小化、平衡和生产MD模拟在本地使用Gromacs2023进行。遵循默认的CHARMM-GUI协议，包括10,000步最速下降能量最小化，随后进行平衡过程。生产模拟在NPT系综中进行，无位置约束。系统温度和压力分别使用Nosé–Hoover恒温器和Parrinello–Rahman恒压器维持在310 K和1 bar。最终，每个系统生成2个100 ns的重复模拟。通过VMD视觉检查、均方根偏差（RMSD）分析和接触分析评估对接复合物的稳定性，以评估化合物在结合口袋内的相互作用和稳定性。
【数据】PDB ID：5YX2-C链；KCl浓度：150 mM；力场：CHARMM36 m；能量最小化步数：10,000步；系综：NPT；温度：310 K；压力：1 bar；恒温器：Nosé–Hoover；恒压器：Parrinello–Rahman；模拟时长：每个系统2 × 100 ns；软件：Gromacs2023
3.4 合成步骤
#### 3.4.1 一般步骤A：化合物4o和4p的合成
将丙二腈（化合物1，5 mmol，1当量）和醛（化合物2，5 mmol，1当量）在水/乙醇混合液（10:1，v/v，0.2 M）中搅拌。混合后，加入间苯二酚（化合物3，5 mmol，1当量）和5% Na2CO3（50 mL，5当量）。反应混合物在室温下搅拌。反应完成后（TLC监测），过滤分离所得固体，用蒸馏水洗涤至pH = 6–7，并在P2O5上干燥。
【数据】丙二腈：5 mmol，1当量；醛：5 mmol，1当量；溶剂：水/乙醇（10:1，v/v，0.2 M）；间苯二酚：5 mmol，1当量；Na2CO3：5%，50 mL，5当量；反应温度：室温；洗涤终点：pH 6–7；干燥剂：P2O5
#### 3.4.2 4-(4-(1H-咪唑-1-基)苯基)-2-氨基-7-羟基-4H-色烯-3-甲腈（4o）
使用一般步骤A合成化合物4o，反应20小时。黄色粉末；产率93%；熔点：198–201 °C；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 9.79 (s, 1H, OH), 8.25 (t, 1H, H2”, J = 1.1 Hz), 7.71 (s, 1H, H5”, J = 1.4 Hz), 7.58 (d, 2H, 8 Hz, H3’ and H5’, J = 8.5 Hz), 7.29–7.32 (d, 2H, 8 Hz, H2” and H6’, J = 8.5 Hz), 7.13 (s, 1H, H4”, J = 1.1 Hz), 6.93 (s, 2H, NH2), 6.83–6.85 (d, 1H, H5, J = 8.5 Hz), 6.50–6.53 (dd, 1H, H6, J = 8.5 Hz, J = 2.4 Hz), 6.45–6.46 (d, 1H, H8, J = 2.4 Hz), 4.73 (s, 1H, H4)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 160.8 (C2), 157.7 (C7), 149.3 (C8a), 145.7 (C1’), 136.0 (C4’ or C2”), 135.9 (C4’ or C2”), 130.4 (C5), 129.9 (C4”), 129.2 (C2’ and C6’), 121.4 (C3’ and C5’), 121.1 (CN), 118.7 (C5”), 113.8 (C4a), 113.0 (C6), 102.7 (C8), 56.4 (C3), 39.8 (C4)。IR (cm-1): 3144 (NH2/OH), 2187 (CN), 1645, 1618, 1583, 1505, 1480, 1436, 1418, 1350, 1305, 1266, 1208, 1154, 1114, 1058, 1032, 964, 925, 893, 870, 851, 809, 789, 756, 741, 690, 657。
【数据】反应时间：20 h；产率：93%；熔点：198–201 °C；1H NMR场强：400 MHz；13C NMR场强：101 MHz；IR特征峰：3144, 2187 cm⁻¹
#### 3.4.3 2-氨基-7-羟基-4-[4-(1,4-氧氮杂环己烷-4-基)苯基]-4H-色烯-3-甲腈（4p）
将丙二腈（0.66 g，10 mmol）和4-(4-甲酰基苯基)吗啉（1.91 g，10 mmol）在H2O（50 mL）和EtOH（5 mL）中搅拌。混合后，加入间苯二酚（1.1 g，10 mmol）和5% Na2CO3（100 mL），然后搅拌6天。用布氏漏斗移除反应溶液，用蒸馏水洗涤至pH = 6–7。产物在含P2O5的真空瓶中干燥。所得粗产物（1.886 g）直接用于后续实验。
【数据】丙二腈：0.66 g，10 mmol；4-(4-甲酰基苯基)吗啉：1.91 g，10 mmol；H2O：50 mL；EtOH：5 mL；间苯二酚：1.1 g，10 mmol；Na2CO3：5%，100 mL；反应时间：6天；粗产物质量：1.886 g；洗涤终点：pH 6–7
#### 3.4.4 步骤B：化合物4p-Bn的合成
将化合物4p（1当量）和K2CO3（1当量）在丙酮（0.07 M）中搅拌，随后加入BnBr（1.2当量）。混合物在55 °C加热48小时。减压蒸发溶剂后，将残余物溶于蒸馏水（0.07 M）并用DCM（0.07 M）萃取。有机层用硫酸钠干燥并蒸发得到粗产物。粗化合物通过硅胶柱层析进一步纯化，得到纯化产物。
【数据】K2CO3：1当量；溶剂：丙酮（0.07 M）；BnBr：1.2当量；温度：55 °C；时间：48 h；萃取剂：DCM（0.07 M）；干燥剂：硫酸钠
#### 3.4.5 2-氨基-7-(苄氧基)-4-[4-(1,4-氧氮杂环己烷-4-基)苯基]-4H-色烯-3-甲腈（4p-Bn）
棕色固体；产率93%；熔点：226–229 °C；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm). 7.31–7.44 (m, 5H, H2” to H6”), 7.03 (d, 2H, H2’ and H6’, J = 8.6 Hz), 6.91 (d, 1H, H5, J = 8.9 Hz), 6.87 (d, 2H, H3’ and H5’, J = 8.6 Hz), 6.84 (ls, 2H, NH2), 6.74 (dd, 1H, J = 8.9 Hz and 2.5 Hz, H6), 6.61(d, 1H, H8, J = 2.5 Hz), 5.09 (s, 2H, CH2), 4.58 (s, 1H, H4), 3.72(t, 4H, J = 4.8, O-CH2), 3.07 (t, 4H, N-CH2, J = 4.8 Hz)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ(ppm) 160.5(C2), 158.3(C7), 150.3(C4’), 149.2(C8a), 137.4(C1’), 137.3(C1”), 130.5(C5), 128.9 (C3” and C5”), 128.4 (C2’ and C6’), 128.4 (C4”), 128.1 (C2” and C6”), 121.1 (CN), 116.6 (C4a), 115.7 (C3’ and C5’), 112.5 (C6), 102.2(C8), 70.0(O-CH2), 66.6 (2 X O-CH2), 57.1 (C3), 49.0 (2 X N-CH2). 39.7(C4)。IR (cm−1): 3403/3331/3214 (NH2), 3033, 2956, 2858, 2816, 2190 (CN), 1981。
【数据】产率：93%；熔点：226–229 °C；1H NMR场强：400 MHz；13C NMR场强：101 MHz；IR特征峰：3403, 3331, 3214, 2190 cm⁻¹
研究结果
2.1 先导化合物选择与计算机优化
#### 2.1.1 先导化合物的选择
DNMT抑制剂基于胞嘧啶——DNMTs识别的天然核碱基——的结构特征进行设计。为保留与胞嘧啶结合相关的关键识别特征，胞嘧啶药效团被保留。为降低非预期DNA嵌入及相关细胞毒性的风险，胞嘧啶药效团与刚性芳香杂环骨架相连（表1）。这种结构修饰增加了与天然核碱基的空间分离，从而降低了在复制或修复过程中嵌入DNA的可能性。采用该设计策略，在我们之前的研究中合成并评估了14个胞嘧啶类似物。随后使用酶学试验评估了它们对DNMT1和DNMT3A的抑制活性，以SGI-1027作为阳性对照。（见图1。）
如表1所示，化合物6b对DNMT3A活性表现出48%的抑制，而对DNMT1未检测到抑制活性，表明具有一定程度的亚型偏好性。为探索与这种偏好性活性相关的可能结合模式，首先使用AutoDock Vina对化合物6b的R-和S-对映体进行分子对接。随后在Discovery Studio 2019中使用蛋白质-配体相互作用协议分析所得结合 pose。对接分析表明，S-对映体可能采用具有更多预测相互作用的 pose（图2A）。S-对映体采用的结合 pose 与辅因子结合位点部分重叠（SAH，图2中以白色表示），而第5位的苯酚部分有效阻断了DNA结合位点的进入，其中吡咯胞嘧啶（PYO，白色环）——一种胞嘧啶类似物——在图2中以蓝色棒状模型表示。这些计算观察结果为配体结合提供了可能的结构假设。然而，本研究未进行实验立体化学分离或验证。因此，S-构型被用作后续计算建模和优化研究的代表性构象。辅因子SAH以白色棒状显示；6b R-和S-对映体分别以青色和粉色显示。
【数据】化合物6b对DNMT3A抑制率：48%；对DNMT1抑制率：未检测到；合成并评估的胞嘧啶类似物：14个；阳性对照：SGI-1027
#### 2.1.2 配体优化
为探索涉及第5位苯酚基团相互作用的潜在改善，我们使用MOE（分子操作环境）软件套件对该区域进行了计算机优化。参与配体识别的关键结合区域如图3所示。所提出的优化模型表明，设计的化合物可能占据辅因子结合位点并可能向DNA结合区域延伸。这些见解指导了化合物6b的计算机优化，该化合物被用作核心骨架生成虚拟库，旨在鉴定更有效的DNMT3A抑制剂。结合MOE中的骨架替换功能，应用了若干物理化学过滤器以改善类药性考量，包括分子量低于500 Da、拓扑极性表面积（TPSA）在40至140 Ų之间、SlogP值在−4至8范围内。5287个过滤后的化合物最初通过刚性对接评估，并根据预测的结合亲和力（Affinity dG评分）排序。选择具有良好合成可及性的化合物，包括简单芳香骨架、有限取代模式和最多一个手性中心，用于进一步考虑。使用FAF-Drugs4平台进行额外过滤，以去除logP值高于3或含有不良反应性或毒性子结构的分子。所有过滤步骤后共剩余82个化合物（图S1）。为评估所选化合物是否保留对DNMT3A的偏好性抑制活性，选择两个计算亲和力良好的代表性化合物6o和6p（图S1）进行合成。合成前，进行分子动力学（MD）模拟以评估这些化合物在DNMT3A活性位点内的结合稳定性。
【数据】分子量阈值：< 500 Da；TPSA范围：40–140 Ų；SlogP范围：−4至8；虚拟库规模：5287个化合物；最终候选：82个化合物；logP阈值：< 3；选择合成的化合物：6o和6p
#### 2.1.3 MD预测化合物与DNMT3A的稳定性
为评估化合物6o和6p在DNMT3A催化口袋中的动态稳定性，对每个复合物进行了两个独立的100 ns MD模拟。如图4A所示，蛋白质骨架RMSD在前20 ns内迅速平衡，并在整个模拟过程中保持稳定，波动不超过约3 Å。这表明DNMT3A在模拟过程中保持了整体结构完整性。两个化合物还表现出较低的配体RMSD值（< 1.5 Å）（图4B），表明6o和6p化合物保持稳定结合且未从结合位点解离。然而，化合物6p显示出比6o更大的波动，表明在口袋内具有更大的灵活性，而6o采样了更紧凑和持久的结合模式。为进一步表征相互作用模式，计算了残基-化合物接触频率（图4C）。两个配体均显示出与位于底物识别和催化区域的残基的反复相互作用，包括D641、G642、I643、P709、R891和S892，这些可能有助于配体在结合口袋内的稳定化。总体而言，这些模拟提供了支持性证据，表明6o和6p均可在模拟时间尺度内维持与DNMT3A催化口袋的稳定相互作用。
【数据】MD模拟时长：每个复合物2 × 100 ns；蛋白质骨架RMSD波动：不超过约3 Å；配体RMSD：< 1.5 Å；关键相互作用残基：D641、G642、I643、P709、R891、S892；平衡时间：前20 ns
2.2 优化化合物的化学合成
化合物6o和6p按照我们之前工作中建立的合成路线合成（见图5）。具体而言，化合物1、2和3在合成序列的第一步中用于制备关键中间体4。中间体4o可通过胺官能化直接与苯甲酰异氰酸酯活化。然而，化合物4p的直接活化导致产率较低。为解决该问题，在苯甲酰异氰酸酯活化之前，用对溴苄基保护4p的羟基，得到中间体4p-Bn。随后，化合物5o或5p-Bn经历环化形成胞嘧啶样杂环结构6o和6p-Bn。对于化合物6p，需要额外的脱氢步骤来完成合成。
【数据】关键中间体：化合物4；保护基：对溴苄基；活化试剂：苯甲酰异氰酸酯；额外步骤：脱氢（仅6p）
2.3 优化化合物的生物学评价
#### 2.3.1 酶活性抑制
评估了化合物6o和6p对重组人DNMT1和催化性DNMT3A复合物的抑制活性（表2）。两个化合物均以微摩尔范围的IC50值抑制DNMT3A活性（31–33 μM，见图S2）。相比之下，在100 μM浓度下对DNMT1仅观察到微弱或无抑制。化合物6o在100 μM时对DNMT1诱导26%的抑制，而6p在相同条件下未显示可检测的抑制。与这些观察一致，在更高浓度（320 μM）下，化合物6o仅对DNMT1表现出微弱抑制（约30%），而化合物6p仍未显示可检测的抑制。尽管效力仍属中等，两个化合物均显示出对DNMT3A优于DNMT1的偏好性活性，表明与设计策略一致的一定程度的亚型偏好性活性。总体而言，数据支持所鉴定的骨架作为DNMT3A偏好性 hits。虽然对DNMT3A观察到的偏好性活性的精确分子决定因素仍有待完全阐明，但化合物是使用DNMT3A/3L晶体结构（PDB：5YX2）设计和优化的。由于所有计算研究仅在DNMT3A上进行，目前无法就其对DNMT1选择性的结构基础建立明确结论。尽管如此，所提出的结合模式表明该骨架可能参与与催化区域的相互作用。
【数据】DNMT3A IC50：31–33 μM；DNMT1抑制（100 μM）：6o为26%，6p为未检测到；DNMT1抑制（320 μM）：6o约30%，6p为未检测到；测试浓度：100 μM、320 μM
讨论与解读
本研究采用理性设计方法鉴定具有潜在DNMT3A偏好性活性的新型胞嘧啶基DNMT抑制剂。通过虚拟筛选和类药性过滤优化核心骨架，获得聚焦的候选化合物集。两个先导化合物被合成，并在酶学试验中表现出对DNMT3A优于DNMT1的偏好性抑制活性。分子动力学模拟进一步表明两个化合物均与DNMT3A稳定结合。此外，化合物在HCT116细胞中表现出抗增殖效果，其中化合物6o显示出更优的抑制活性。虽然在基于细胞的试验中未观察到DNMT1或DNMT3A蛋白表达的显著变化，但这些化合物代表了有前景的早期 hits，可作为未来开发DNMT3A偏好性抑制剂的起点。
编译者解读
该研究的亮点在于以胞嘧啶药效团为锚点、刚性芳香杂环为骨架的设计逻辑——既保留DNMT识别特征，又通过空间位阻规避DNA嵌入毒性。MOE骨架替换结合多级过滤将5287个虚拟分子精简至82个，体现了计算驱动合成的效率。但需注意：IC50约30 μM的效力仍属中等，且选择性机制未获结构生物学验证；细胞层面未见蛋白表达改变，提示其功能可能限于酶活抑制。后续若结合共晶结构解析和体内药效评估，有望推动这类非核苷抑制剂走向实用。
参考来源
期刊：Bioorganic Chemistry, 2026
DOI：10.1016/j.bioorg.2026.110025
DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.110025