基于酶切肽抗污染电化学发光生物传感器

来源：Novel peptide-cleaving anti-fouling electrochemiluminescence biosensor for ultrasensitive detection of matrix metalloproteinase 14（Sensors and Actuators B: Chemical）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

血清中疾病生物标志物的精准检测常受电极表面非特异性蛋白吸附的严重干扰。本研究设计了一条兼具抗污染序列与MMP 14特异性切割位点的功能化长肽（Pep），将其作为识别单元与铜纳米簇（Cu NCs）电化学发光（ECL）探针偶联，构建了一种新型抗污染ECL生物传感器。该传感器在100 fg/mL至100 ng/mL范围内呈强线性响应，检测限低至35 fg/mL，并能在血清中保持稳定性能。

研究背景

基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌依赖性蛋白酶，广泛参与多种生理与病理过程。其异常表达与肿瘤侵袭和转移密切相关，是癌症早期诊断的重要生物标志物。MMPs主要由肿瘤细胞表达并主动分泌至细胞外基质中。在这一环境中，干扰蛋白和内源性代谢物在探针表面的非特异性吸附会导致假阳性信号，严重损害疾病生物标志物的准确检测。因此，亟需开发同时具备抗污染性能和高特异性的检测平台。

目前常用的MMPs检测方法主要包括荧光法、酶联免疫吸附测定、表面增强拉曼散射法及相关联用技术。其中，电化学发光（ECL）因具有检测灵敏度高、背景低、动态范围宽和操作简便等显著优势，在肿瘤标志物分析中展现出巨大潜力。然而，传统ECL材料存在诸多固有局限：鲁米诺的ECL效率相对较低，[Ru(bpy)₃]²⁺成本高昂，多种量子点则受困于水溶性差等问题。

本研究设计了一条功能化长肽（Pep），其序列同时包含抗污染片段和MMP 14特异性识别与水解的底物序列。该肽段与铜纳米簇（Cu NCs）偶联作为ECL探针，靶标MMP 14对肽段的切割导致ECL信号显著下降，从而实现MMP 14的超灵敏检测。

研究方法

2.1 试剂与仪器

肽的氨基酸序列为CDKDKPLPLRSWGLKNQN，其中C、D、K、P、L、R、S、W、G、N和Q分别代表半胱氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸、精氨酸、丝氨酸、色氨酸、甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。该肽段购自生工生物工程（上海）股份有限公司。试剂与仪器的详细信息见支持信息。

【数据】肽序列：CDKDKPLPLRSWGLKNQN；肽来源：生工生物工程（上海）股份有限公司；其余试剂仪器信息：原文未详述（见支持信息）

2.2 Cu NCs的合成

Cu NCs的合成在先前报道方法的基础上进行优化。首先，将0.02 g五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）、92 μL乙二胺（EDA）和0.141 g L-抗坏血酸（AA）依次溶解于24 mL超纯水中。磁力搅拌获得均匀溶液后，用1 M氢氧化钠将混合物pH调节至约4.5。随后，将溶液加热至37 °C并在该温度下孵育4 h。自然冷却至室温后，使用截留分子量为1000 Da的透析膜在持续搅拌下透析24 h。最后，将透析后的样品在4 °C避光条件下保存。

【数据】CuSO₄·5H₂O：0.02 g；EDA：92 μL；L-抗坏血酸：0.141 g；超纯水：24 mL；pH：约4.5（用1 M NaOH调节）；加热温度：37 °C；孵育时间：4 h；透析膜截留分子量：1000 Da；透析时间：24 h；保存条件：4 °C避光

2.3 Pep-Cu NCs的制备

取500 μL上述制备的Cu NCs与500 μL 1 mg/mL Pep溶液混合，在室温下振荡孵育过夜，经纯化后获得Pep-Cu NCs。

【数据】Cu NCs体积：500 μL；Pep浓度：1 mg/mL；Pep体积：500 μL；孵育条件：室温振荡过夜

2.4 抗污染性能表征

将工作电极分别浸入一系列不同稀释度的蛋白质、氨基酸和胎牛血清（FBS）溶液（用PBS配制）中，在室温下静置1 h。记录蛋白质孵育前后的差分脉冲伏安法（DPV）峰电流，分别记为I₀和I。信号抑制率按R = (I₀ - I)/I₀计算。该比值越高，表明电极表面生物污染越严重，抗污染性能越差。

【数据】孵育温度：室温；孵育时间：1 h；信号抑制率公式：R = (I₀ - I)/I₀；测试溶液：蛋白质、氨基酸、FBS系列稀释液（PBS配制）

2.5 ECL生物传感器的构建

生物传感器的制备如方案1所示。首先，将金电极（AuE）用氧化铝抛光，然后在超纯水中超声彻底清洗。接着，将6 μL制备好的Pep-Cu NCs固定在电极表面，室温孵育过夜以促进Au-S键的形成。然后，将6 μL 1%牛血清白蛋白（BSA）固定在电极表面孵育30 min以封闭非特异性吸附。之后，将6 μL MMP 14溶液滴加至电极表面，在湿润环境中孵育，使MMP 14特异性切割肽段。以上所有操作均在室温下完成。在每次添加后续试剂之前，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗体系以去除未结合的物质。

【数据】Pep-Cu NCs用量：6 μL；Au-S键形成孵育条件：室温过夜；BSA浓度：1%；BSA用量：6 μL；BSA孵育时间：30 min；MMP 14用量：6 μL；MMP 14孵育条件：室温湿润环境；冲洗液：PBS；所有操作温度：室温

研究结果

3.1 Cu NCs的表征

采用透射电子显微镜（TEM）和高分辨透射电子显微镜（HRTEM）对Cu NCs的形貌进行表征。图1A显示，所制备的Cu NCs呈圆形形貌，分散良好，无明显团聚。从图1B的尺寸分布图可以看出，其平均直径约为2.92 nm。此外，在图1C中可观察到归属于Cu（200）晶面的清晰晶格条纹。进一步通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征Cu NCs的表面键合性质。根据图1D，在3300–3500 cm⁻¹范围内出现两个明显的吸收峰（曲线a），这是伯胺（-NH₂）的特征峰。相比之下，在3300–3500 cm⁻¹处出现单一吸收峰（曲线b），对应仲胺（-NHR）的N-H伸缩振动。这表明EDA的两个氨基均与铜配位。此外，在500–600 cm⁻¹处出现一个新的强吸收峰，归属于Cu-N伸缩振动，验证了铜与EDA之间的配位相互作用。进一步用紫外-可见光谱（UV–vis）对CuSO₄溶液和Cu NCs进行表征。CuSO₄溶液在302 nm处出现明显吸收峰，而所制备的Cu NCs中该峰消失（图1E）。这一现象表明Cu NCs已成功制备。在UV–vis光谱范围内，Cu NCs的吸收强度随波长增加而显著降低。在500–600 nm范围内未观察到明显吸收峰，该范围通常与大尺寸铜纳米颗粒的特征吸收带相关。这表明成功合成了小尺寸Cu NCs。

【数据】Cu NCs平均直径：约2.92 nm；晶面：(200)；FT-IR伯胺特征峰范围：3300–3500 cm⁻¹；Cu-N伸缩振动峰：500–600 cm⁻¹；CuSO₄吸收峰：302 nm；大尺寸铜纳米颗粒特征带：500–600 nm（未观察到）

X射线光电子能谱（XPS）探测了所制备Cu NCs的化学状态和表面组成。如图2A所示，XPS分析证实了EDA稳定的Cu NCs中存在Cu、C和N元素。高分辨Cu 2p谱（图2B）显示在933.1 eV（Cu 2p3/2）和952.4 eV（Cu 2p1/2）处有两个强峰，表明Cu NCs中Cu(0)和Cu(I)物种共存。在942.0 eV处未观察到明显峰，证实不存在Cu(II)物种。934.4 eV处的峰对应Cu-N键。如图2C所示，Cu NCs的高分辨C 1s谱揭示了C-C/C-H（284.8 eV）和C-N（286.0 eV）的存在。Cu NCs的高分辨N 1s谱（图2D）显示C-N（399.5 eV）和-NH₃⁺（401.2 eV）。这些结果共同表明EDA成功结合到Cu NCs表面。为评估Cu NCs的光学性质，进行了光致发光（PL）光谱和PL寿命测量。如图2E所示，Cu NCs在362 nm激发下于452 nm处出现发射峰。PL寿命衰减曲线（图2F）良好拟合于双指数函数，得到Cu NCs的PL衰减时间为4.76 ns（表S1），与其蓝色荧光发射一致。

【数据】Cu 2p3/2峰：933.1 eV；Cu 2p1/2峰：952.4 eV；Cu(II)特征峰：942.0 eV（未观察到）；Cu-N键峰：934.4 eV；C-C/C-H峰：284.8 eV；C-N峰：286.0 eV；N 1s C-N峰：399.5 eV；N 1s -NH₃⁺峰：401.2 eV；PL激发波长：362 nm；PL发射峰：452 nm；PL衰减时间：4.76 ns

3.2 生物传感器可能的ECL机制探究

为进一步探究Cu NCs的发光机制，在不同电位下记录了ECL光谱，结果如图3A所示。Cu NCs的三维（3D）ECL光谱表明其发射波长为567 nm。同时，Cu NCs在1.0–1.6 V的电化学刺激下可被氧化，在1.5–1.6 V时获得最强的ECL响应。此外，将Cu NCs的ECL光谱与PL发射光谱进行比较。Cu NCs的PL发射波长测得为452 nm（图3B），其ECL发射相对于PL表现出显著红移。这表明Cu NCs的ECL发射源于表面态而非带隙跃迁。为进一步了解Cu NCs在溶液中的ECL机制，系统比较了不同修饰电极的ECL响应。如图3C所示，AuE在含三乙胺（TEA）的PBS中无明显ECL响应（曲线a）。对于Cu NCs/AuE，在PBS中ECL信号可忽略（曲线b）；然而，在含TEA的PBS中观察到强信号（曲线c）。这些发现表明TEA作为共反应物参与了Cu NCs的ECL反应。图3D中的a和b面板分别提供了描述这两种现象的示意图。参考类似的ECL机制，Cu NCs/TEA复合体系可能的ECL机制可表述为：TEA失去电子被氧化形成TEA•⁺（式1），然后失去质子形成TEA•（式2）。同时，Cu NCs失去电子被氧化形成Cu NCs•⁺（式3）。随后，TEA•与Cu NCs•⁺反应形成激发态Cu NCs（式4）。当Cu NCs返回基态时，检测到ECL信号（式5）。综上，可能的反应机制如下：（1）TEA - e⁻ → TEA•⁺；（2）TEA•⁺ → TEA• + H⁺；（3）Cu NCs - e⁻ → Cu NCs•⁺；（4）Cu NCs•⁺ + TEA• → Cu NCs；（5）Cu NCs → Cu NCs + hν。

为进一步阐明所开发生物传感器的ECL行为，比较了不同电极制备阶段获得的ECL响应，如图3C所示。Pep-Cu NCs（曲线d）和BSA（曲线e）依次修饰在电极表面，形成致密的生物修饰层。该结构显著阻碍了电极表面的界面电子转移，导致相关ECL信号强度逐渐降低。引入MMP 14后（曲线f），Pep被MMP 14特异性切割，导致部分携带Cu NCs的肽段脱落。因此，ECL信号急剧下降（图3D，面板c）。

【数据】Cu NCs ECL发射波长：567 nm；Cu NCs氧化电位范围：1.0–1.6 V；最强ECL响应电位：1.5–1.6 V；PL发射波长：452 nm；ECL相对于PL：显著红移；AuE在含TEA的PBS中：无明显ECL响应；Cu NCs/AuE在PBS中：ECL信号可忽略；Cu NCs/AuE在含TEA的PBS中：强信号

3.3 Pep的抗污染性能

为评估Pep的抗污染能力，将电极浸入含单一蛋白质的不同浓度溶液中孵育1 h。随后记录其DPV响应，如图S1-S3所示。本研究采用带正电荷的组氨酸（His）、带负电荷的BSA和近电中性的肌红蛋白（Mb）作为干扰物。通过信号抑制率评估电极的抗污染能力。由于裸电极表面的强非特异性吸附，信号抑制显著加剧，DPV响应下降约40%。然而，Pep和BSA的逐层修饰有效提高了表面对非特异性蛋白质吸附的抵抗能力。因此，相应的DPV信号损失分别降至约13%和12%。此外，评估了生物传感器（MMP 14/BSA/Pep/AuE）的抗污染性能。DPV信号显示下降约16%。这些结果表明Pep的引入显著增强了生物传感器的抗污染能力。为评估生物传感器在复杂生物环境中的抗污染性能，将其在不同浓度的FBS中连续浸泡1 h。然后观察并记录DPV信号的变化（图4A-E）。有趣的是，生物传感器在浸入FBS后表现出优异的抗污染能力，结果与蛋白质溶液相似。水接触角分析表明，相对于裸电极，肽修饰电极的水接触角从63.12°降至31.57°（图4F和表S2）。这些结果表明Pep具有优异的亲水性和抗污染性能。

【数据】孵育时间：1 h；裸电极DPV信号下降：约40%；Pep修饰后DPV信号损失：约13%；BSA/Pep修饰后DPV信号损失：约12%；MMP 14/BSA/Pep/AuE DPV信号下降：约16%；FBS浸泡时间：1 h；裸电极水接触角：63.12°；肽修饰电极水接触角：31.57°

3.4 生物传感器的可行性研究

采用电化学阻抗谱（EIS，图5A）、ECL（图5B）和循环伏安法（CV，图5C）对（a）裸AuE、（b）Pep-Cu NCs/AuE、（c）BSA/Pep-Cu NCs/AuE和（d）MMP 14/BSA/Pep-Cu NCs/AuE进行表征。同时，通过等温滴定量热法（ITC）分析了MMP 14与Pep之间的相互作用（图5D）。

【数据】表征方法：EIS、ECL、CV、ITC；电极：（a）裸AuE、（b）Pep-Cu NCs/AuE、（c）BSA/Pep-Cu NCs/AuE、（d）MMP 14/BSA/Pep-Cu NCs/AuE；具体数值：原文未详述（见原文图5）

3.5 实验条件优化

对ECL生物传感器的实验条件进行了优化，包括pH（图6A三维图和图6B二维图）、终止电位（图6C）、共反应物TEA浓度（图6D三维图和图6E二维图，图6F）、Pep浓度（图6G三维图和图6H二维图）以及孵育时间（图6I）。

【数据】优化条件：pH、终止电位、TEA浓度、Pep浓度、孵育时间；具体数值：原文未详述（见原文图6）

3.6 生物传感器的分析性能

评估了生物传感器的分析能力。图7A显示了生物传感器在不同浓度MMP 14中的ECL响应。图7B为不同浓度MMP 14的标准曲线。该生物传感器在100 fg/mL至100 ng/mL浓度范围内表现出强线性响应，检测限为35 fg/mL。图7C展示了电化学稳定性和ECL稳定性（插图：ECL强度测试）。图7D为重现性，图7E为选择性，图7F为抗干扰能力。

【数据】线性范围：100 fg/mL至100 ng/mL；检测限：35 fg/mL；稳定性、重现性、选择性、抗干扰性具体数值：原文未详述（见原文图7）

讨论与解读

本研究开发了一种基于酶切肽的抗污染ECL生物传感器，用于MMP 14的精准检测。所设计的肽段作为识别元件具有多重功能：其一，通过消除电荷吸引和阻碍蛋白质及激素的非靶标吸附，增强了生物传感器的抗污染能力；其二，为纳米簇提供结合位点以实现ECL信号输出；最重要的是，该肽段可被MMP 14特异性识别和切割，从而提高了生物传感器的特异性。这种通过肽策略整合抗污染与信号识别的方案，在快速临床诊断中展现出可观的应用潜力。

编译者解读：该工作的亮点在于将抗污染肽序列与酶切底物序列整合于单一肽链，巧妙实现了"识别-抗污-信号输出"三功能合一。选择铜纳米簇作为ECL探针兼顾了低成本与良好水溶性，规避了传统钌配合物和量子点的缺陷。检测限达35 fg/mL，在复杂血清环境中仍保持稳定，显示出临床转化潜力。不过，当前验证仅停留在缓冲液和FBS加标层面，尚未在真实临床样本中系统评估；肽段的体内稳定性与批间一致性也是未来走向应用需解决的问题。

参考来源

期刊：Sensors and Actuators B: Chemical, 2026

DOI: 10.1016/j.snb.2026.140629

DOI: 10.1016/j.snb.2026.140629