来源：Foods | 编译：DNA Lab Space
导语
蛋白质谷氨酰胺酶（Protein Glutaminase, PG）能够特异性催化蛋白质中谷氨酰胺残基发生脱酰胺反应，是改善食品蛋白质功能特性的重要酶制剂。然而，传统PG纯化工艺复杂、成本高昂，限制了其在食品工业中的规模化应用。本研究采用细胞表面展示技术，将PG展示于微生物细胞表面，实现酶的一步纯化，并成功将其应用于磷虾蛋白的脱酰胺改性，显著提升蛋白溶解性与乳化特性，为食品酶制剂制备和蛋白质利用提供了新思路。
研究背景
磷虾蛋白因其氨基酸组成均衡、必需氨基酸含量丰富，被视为优质的新型食品蛋白质资源。然而，天然磷虾蛋白在水中的溶解性差，尤其在等电点附近易发生聚集沉淀，导致其乳化性、起泡性和凝胶性等加工性能不理想，严重制约了其在饮料、乳制品及肉制品中的应用。蛋白质脱酰胺是一种有效的蛋白质改性手段，可将蛋白质侧链上的谷氨酰胺残基转化为谷氨酸残基，增加蛋白质表面的负电荷密度，从而增强分子间静电排斥，提高蛋白质在酸性及中性条件下的溶解性。蛋白质谷氨酰胺酶作为一种专门催化谷氨酰胺残基脱酰胺的酶，反应条件温和、底物特异性强，在食品蛋白质改性中具有独特优势。然而，PG的天然来源产量低，传统纯化涉及多步层析，酶活损失大，成本高昂。因此，开发一种简单、高效、低成本的PG制备方法成为食品生物技术领域的研究热点。细胞表面展示技术通过将目标酶与细胞壁锚定蛋白融合表达，使酶牢固地展示在微生物细胞表面，无需细胞破碎和层析纯化，仅通过离心即可获得固定化酶。该技术不仅能显著简化酶制剂生产工艺，还能提高酶的稳定性和重复使用性。本研究正是利用这一策略，开展PG的细胞表面展示纯化，并探索其催化磷虾蛋白脱酰胺改性的可行性。
研究方法
本研究的总体技术路线分为两个部分：一是构建细胞表面展示系统并纯化PG，二是将展示形式的PG用于磷虾蛋白的脱酰胺改性研究。
在细胞表面展示系统的构建中，研究者首先将编码PG的成熟肽基因与一种合适的细胞壁锚定蛋白基因进行融合。锚定蛋白通常取自具有较强细胞壁结合能力的蛋白，如酵母α-凝集素（α-agglutinin）或Aga2p等。通过基因工程手段，构建出含有融合基因的表达载体。该载体携带了合适的启动子、分泌信号肽以及筛选标记，然后将载体转化进入宿主微生物，例如酿酒酵母或大肠杆菌。在诱导条件下，宿主细胞表达融合蛋白，并依靠锚定蛋白将PG定向固定于细胞表面。随后，通过简单的离心和洗涤步骤，收集细胞沉淀，即得到了表面展示有PG的全细胞催化剂。该过程避免了传统细胞破碎、裂解液澄清以及亲和层析等繁琐步骤，实现了“表达—固定化—纯化”一体化。为了验证展示是否成功，研究者使用特异性底物或免疫荧光标记检测细胞表面的PG活性，并进一步考察了温度、pH对酶活性的影响以及酶的储存稳定性和重复使用性。
在磷虾蛋白脱酰胺改性实验中，研究者将磷虾蛋白分散于适当的缓冲体系中，加入制备好的表面展示PG全细胞催化剂，在一定温度下反应一定时间。反应结束后，离心去除细胞，收集上清液测定脱酰胺度、蛋白质溶解度、乳化活性指数和乳化稳定性指数等指标。脱酰胺度的测定通常基于氨释放量或谷氨酸生成量来计算。同时，设置未处理样品和游离酶处理组作为对照，以评价细胞表面展示PG的催化效率和改性效果。
研究结果
研究结果显示，细胞表面展示技术成功实现了PG在微生物细胞表面的功能性表达。经过诱导后，细胞表面检测到了明显的PG催化活性，说明融合蛋白正确折叠并锚定于细胞壁。与游离PG相比，展示形式的PG表现出相似的酶学特性，但其热稳定性和pH耐受范围有所拓宽，这可能是由于细胞表面微环境对酶分子起到了保护作用。更重要的是，该全细胞催化剂可以通过简单的离心回收，重复使用多次后仍能维持较高的酶活力，显著降低了酶制剂的使用成本。在磷虾蛋白脱酰胺改性实验中，经细胞表面展示PG处理后，磷虾蛋白溶液的脱酰胺程度明显上升，说明酶有效作用于蛋白质侧链的谷氨酰胺残基。伴随脱酰胺反应的进行，蛋白质的溶解度在不同pH条件下均得到显著改善，尤其是在pH 4–6范围内，原本易发生沉淀的蛋白质变得分散均匀，这主要归因于谷氨酰胺转化为谷氨酸后增强了蛋白质分子的静电排斥作用。此外，乳化活性和乳化稳定性也较未处理样品显著增强，表明脱酰胺后的磷虾蛋白能够在油水界面形成更牢固的蛋白质膜，有利于在乳化类食品中应用。值得一提的是，反应结束后，细胞表面展示PG通过简单离心即可与产物分离，避免了传统酶制剂残留在产品中的问题，简化了后续纯化步骤，并有利于酶的循环使用。这些结果共同证明，基于细胞表面展示策略所获得的PG在磷虾蛋白脱酰胺改性中具有优异的效果和良好的工业应用前景。
讨论与展望
本研究的意义在于将细胞表面展示技术引入食品酶制剂的生产中，为解决PG纯化瓶颈提供了有效方案。传统的酶纯化工艺往往涉及细胞破碎、超速离心和柱层析等多个步骤，不仅耗时耗能，而且酶活损失大。通过将PG展示在细胞表面，研究人员无需破碎细胞，仅通过离心即可获得固定在细胞表面的酶催化剂，极大简化了制备流程，并且赋予酶可回收、可重复使用的特性，有助于降低生产成本。该策略不仅适用于PG，也有望推广至其他食品用酶的制备。在磷虾蛋白加工方面，本研究证实了脱酰胺改性可有效提升磷虾蛋白的溶解性和乳化性能，这为磷虾蛋白在饮料、酱料及人造肉等产品中的应用打开了空间。未来可在以下几个方向深化研究：一是进一步优化锚定蛋白和宿主表达系统，提高PG的展示密度和催化效率；二是探索细胞表面展示PG对其他植物或动物蛋白的脱酰胺效果；三是开展放大试验和安全性评价，推动该技术的产业化落地。此外，利用细胞表面展示系统与连续化反应器结合，有望实现蛋白质改性的连续化生产，进一步提升食品加工效率和可持续性。
参考来源
期刊：Foods
DOI：未提供（请参见原文信息）
作者：Zhang J, Zhang Y, Wang T, Li X, An X.