来源：mSphere | 编译：DNA Lab Space
导语
烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是免疫缺陷患者中最为常见的机会性致病真菌之一，其致病性高度依赖于对宿主微环境胁迫的适应能力。近年来，长链非编码RNA（lncRNA）在真菌调控网络中的作用逐渐受到关注，但相关功能研究在烟曲霉中仍十分有限。本研究报道了一个新鉴定到的lncRNA——afu-254，通过基因敲除与回补实验，系统证明afu-254同时参与烟曲霉的氧化应激响应、细胞壁应激响应、唑类药物敏感性以及毒力调控，为理解真菌非编码RNA的生物学功能及开发新型抗真菌策略提供了重要线索。
研究背景
烟曲霉广泛存在于自然环境中，其分生孢子可被人体吸入，在免疫功能正常个体中通常被清除或仅引起局部炎症，而在中性粒细胞减少、器官移植或长期使用免疫抑制剂的患者中，则可引发侵袭性曲霉病，病死率极高。耐药问题特别是对唑类药物的耐药性日趋严重，使得揭示烟曲霉适应宿主环境并抵抗抗真菌药物的分子机制成为临床亟需。
真菌在感染过程中需应对宿主吞噬细胞产生的氧化应激、抗真菌药物引起的细胞壁损伤等压力。细胞壁完整性信号通路和氧化应激响应通路是烟曲霉致病过程中至关重要的防御机制。长期以来，有关上述通路的研究主要集中于转录因子和蛋白激酶，而对非编码RNA，尤其是长链非编码RNA的调控作用认识不足。lncRNA是指长度超过200个核苷酸、一般不编码蛋白质的RNA分子，已被证实在哺乳动物中广泛参与转录调控、染色质重塑及RNA加工等过程，在酿酒酵母等模式真菌中也有功能报道，但在丝状真菌中的系统性研究尚处早期。本研究从烟曲霉基因组中筛选并锁定一个特定lncRNA afu-254，围绕其在应激响应和致病性中的作用进行了深入解析。
研究方法
该研究采用“基因敲除-表型分析-回补验证”的经典反向遗传学技术路线。首先，研究者通过生物信息学手段在烟曲霉基因组中确定afu-254的基因座，进而利用同源重组策略用筛选标记替换其编码区，构建afu-254缺失突变株。为了排除敲除导致的非特异性效应，研究者又通过将含afu-254全长序列的完整基因片段随机整合至基因组的方法构建了回补菌株，确保所有表型差异均可归因于afu-254的缺失。
在表型分析层面，研究设置了多个实验体系。针对氧化应激响应，采用过氧化氢、三丁基氢过氧化物等氧化剂处理固体或液体培养基，比较野生型、敲除株和回补株在不同氧化剂浓度下的菌落生长速度及孢子萌发率。针对细胞壁应激，使用刚果红、荧光增白剂和十二烷基硫酸钠等细胞壁干扰剂处理菌株，以检测细胞壁完整性。唑类药物敏感性实验则参考临床实验室标准，利用微量液基稀释法测定菌株对伊曲康唑、伏立康唑等常见唑类药物的最低抑菌浓度，同时也在含药平板上进行斑点培养以直观观察生长差异。毒力实验采用大蜡螟幼虫或免疫抑制小鼠感染模型，监测感染后宿主的存活曲线，并测定肺组织真菌负荷、组织病理学改变等指标。此外，研究者还利用定量逆转录PCR技术分析了afu-254的转录水平，并尝试筛选其可能调控的下游靶基因。
研究结果
研究结果表明，afu-254缺失后烟曲霉的应激适应性明显受损。在氧化应激条件下，敲除株在过氧化氢培养基上的生长受到显著抑制，菌落直径较野生型显著缩小，而回补株则恢复到野生型相近水平，证明afu-254是氧化应激响应所必需。对细胞壁应激的检测发现，afu-254缺失株对刚果红和荧光增白剂的敏感性升高，提示其细胞壁完整性受到破坏，说明该lncRNA参与维持细胞壁的正常结构与功能。在唑类药物敏感性方面，敲除株对伊曲康唑和伏立康唑的最低抑菌浓度显著降低，生长抑制效果增强，即敲除afu-254使烟曲霉变得对唑类药物更加敏感，这暗示afu-254可能通过某种机制参与固有耐药或药物外排的调控。
更值得关注的是毒力实验的结果。在动物感染模型中，感染afu-254敲除株的实验组存活率明显高于感染野生型菌株的对照组，肺组织匀浆中的真菌负荷也显著下降，组织病理学切片显示炎症浸润和菌丝侵袭程度较轻。这些结果充分表明，afu-254是烟曲霉完整的毒力发挥所必需的。通过回补afu-254表达，毒力缺陷和应激敏感性均被恢复到野生型水平，进一步确认了该lncRNA的特异性功能。综合来看，afu-254在烟曲霉抵抗氧化攻击、维持细胞壁稳定、耐受唑类药物以及成功感染宿主等多个关键环节中均发挥着不可或缺的作用，是一个多效性的调控节点。
讨论与展望
本研究首次将lncRNA afu-254与烟曲霉的应激响应和致病性联系在一起，拓展了真菌非编码RNA研究的新疆域。afu-254的缺失同时影响多个不同的应激通路和药物敏感性，提示其可能位于一个上游调控节点，通过调控某些核心转录因子或信号通路组分，进而产生多效性表型。鉴于细胞壁应激与氧化应激通路之间存在交叉对话，afu-254或许在这一交叉网络中也扮演着特殊角色。其参与唑类药物敏感性的调控更是一个令人兴奋的发现，因为唑类药物靶向的是麦角甾醇生物合成通路，afu-254很可能通过影响药物靶点表达、药物外排泵或应激补偿通路来改变菌株的耐药水平。
当然，目前对afu-254的直接分子机制所知有限。它如何与染色质重塑复合物或转录因子互作，又调控哪些靶基因，以及是否通过与蛋白质或microRNA样小RNA结合发挥作用，都有待进一步研究。未来可利用RNA pull-down、染色质免疫共沉淀测序及转录组学等技术构建afu-254介导的调控网络。此外，临床分离的唑类耐药菌株中afu-254的表达水平变化也是一个值得关注的方向，若afu-254的过表达与耐药相关，则可能成为预测耐药或逆转耐药的潜在靶点。总体而言，这项工作为理解烟曲霉胁迫适应机制增添了新的维度，也为设计针对非编码RNA的抗真菌干预策略打开了想象空间。
参考来源
Devkota R, Poudyal NR, Reyes Servin J, Lenz J, Shepardson KM. A long non-coding RNA, afu-254, is required for the oxidative stress response, cell wall stress response, azole susceptibility, and virulence in Aspergillus fumigatus. mSphere, 2025. DOI: 10.1128/msphere.00000-00（需核对原文DOI）