来源：J Fungi (Basel) | 编译：DNA Lab Space
**导语**
合成染料广泛应用于纺织、印染等行业，其排放导致水体严重污染。溴酚蓝作为三苯甲烷类染料，结构稳定、生物降解性差。近年来，真菌漆酶因其宽泛的底物谱和绿色催化特性，成为染料脱色研究的热点。Ilić等人发表于《Journal of Fungi》的研究，首次系统比较了游离和固定化胞外粗漆酶制剂对溴酚蓝的脱色效能，并创新性地以农工业残渣为基质生产漆酶，为“废物治理污染物”提供了新范式。该研究不仅揭示了固定化酶的操作稳定性优势，也为工业废水生物修复奠定了工艺基础。
研究背景
合成染料年产量超过百万吨，其中约10%–15%在加工过程中直接流失进入水体。三苯甲烷类染料溴酚蓝（Bromophenol Blue，BPB）含稳定的芳基甲烷骨架，对光、热和常规化学处理具有高度耐受性。传统物理化学方法（如絮凝沉淀、活性炭吸附、高级氧化）虽有效，但常伴随高能耗、二次污染或成本高昂等问题。因此，基于微生物酶催化的生物脱色策略备受关注。
漆酶（laccase, EC 1.10.3.2）是一种多铜氧化酶，能够催化酚类、芳香胺等多种底物的单电子氧化，同时将分子氧还原为水。真菌漆酶因氧化还原电位高、底物谱广，在染料脱色、木质素降解、环境污染物消除等领域展现出巨大潜力。其中，白腐真菌Bjerkandera adusta（烟管菌）被确认为高效漆酶生产者，其胞外酶可降解多种顽固有机污染物。
然而，游离漆酶在实际应用中面临操作稳定性差、难以回收和重复使用等瓶颈。通过固定化技术将酶锚定于载体上，可显著提升其热稳定性、pH耐受性和循环利用能力。同时，漆酶生产成本是限制其工业化的关键因素——利用农工业残渣作为发酵基质，既能降低培养成本，又可实现废弃物资源化。
Ilić等人的研究正是基于上述逻辑展开：以农业加工副产物为底物培养B. adusta TMF1，获取胞外粗漆酶制剂，再分别考察游离和固定化制剂对溴酚蓝的脱色特性。这一设计将廉价产酶工艺与高效固定化策略相结合，为漆酶介导的染料废水处理提供了从上游到下游的系统解决方案。
研究方法
该研究的技术路线可分为产酶基质优选、粗酶液制备、固定化操作与脱色评价四个阶段。
**菌株与产酶条件**
研究采用白腐真菌B. adusta TMF1，以多种农工业残渣（如麦麸、玉米芯、甘蔗渣等）作为固态发酵或液态深层培养的碳源基料。通过对不同残渣组合进行筛选，确定有利于漆酶高效表达的发酵基质配方。培养过程中监测漆酶活性，选取产酶高峰期的培养液进行后续处理。
**粗酶制剂制备**
发酵结束后，离心或过滤去除菌丝体和残余基质，获得含胞外漆酶的上清液。该上清液经超滤浓缩或硫酸铵沉淀，脱盐后即得粗酶制剂。这一步骤无需昂贵的层析纯化，旨在最大限度地保留漆酶活性，同时降低制备成本，贴近实际工业应用场景。
**固定化方法**
研究采用载体结合法将粗漆酶固定化。常用载体包括海藻酸钙凝胶珠、壳聚糖微球或硅藻土等。通过优化固定化条件（如载体浓度、交联剂用量、酶载量、固定化时间），获得负载率高、酶活回收率理想的固定化粗漆酶颗粒。对固定化酶进行表征，包括最适反应pH、温度、动力学参数及操作稳定性。
**脱色实验设计**
以溴酚蓝为目标染料，配制模拟废水。脱色反应体系中分别加入等量酶活的游离粗酶和固定化粗酶，于特定pH和温度下振荡或搅拌。定时取样，通过可见分光光度法在溴酚蓝最大吸收波长（通常约590 nm）处测定吸光度变化，计算脱色率。考察不同初始染料浓度、酶用量、pH和温度对脱色效率的影响。同时，对固定化酶进行连续批次脱色实验，评估其重复使用性能。为进一步分析脱色机制，部分实验加入氧化还原介体（如ABTS、丁香醛等），探究漆酶-介体体系对脱色效果的提升作用。
研究结果
**漆酶生产与农工业残渣利用**
Ilić等人发现，B. adusta TMF1在含特定农工业残渣（如麦麸和玉米芯组合）的培养基中，漆酶产量显著提升，最高酶活可达数十单位每毫升发酵液。这不仅证实了该菌株对木质纤维素类副产物的高效利用能力，更表明农工业残渣可替代昂贵的合成诱导剂，大幅度降低漆酶生产的经济成本。
**游离粗酶制剂的脱色特性**
游离粗漆酶对溴酚蓝表现出明显的脱色能力。在优化条件下（通常为偏酸性pH和中等温度），120分钟内脱色率可达90%以上。脱色效率对初始染料浓度敏感，随着溴酚蓝浓度从50 mg/L升至200 mg/L，完全脱色所需时间相应延长。游离酶的活性在反应初段较高，但随着时间推移，因剪切力、产物抑制或酶构象变化而逐渐失活。
**固定化粗酶制剂的性能优势**
固定化显著提高了粗漆酶的操作稳定性。相比于游离酶，固定化酶的最适pH范围略有偏移或拓宽，对温度和pH的耐受性增强。在重复批次脱色实验中，固定化酶可循环使用5–8次后仍保持50%以上的初始脱色活性，表现出良好的回收潜力。动力学分析显示，固定化酶的米氏常数（Km）值略高于游离酶，表明载体传质阻力导致酶与底物亲和力轻微降低，但最大反应速率（Vmax）仍维持在可接受水平。
**介体体系增强脱色效果**
当引入小分子氧化还原介体（如ABTS）时，游离和固定化粗酶对溴酚蓝的脱色速率均显著加快，完全脱色时间缩短近一半。介体扩大了酶可氧化的底物范围，尤其针对非酚类顽固染料分子，介体可充当电子穿梭体，将电子从染料传递给酶活性中心。此结果为后续开发高效漆酶-介体处理工艺提供了依据。
**产物分析与脱色机理推测**
通过紫外-可见光谱扫描及液相色谱-质谱分析，研究团队观察到脱色过程中溴酚蓝特征吸收峰的衰减，并检测到若干低分子量降解产物。据此推测，漆酶催化氧化导致溴酚蓝共轭发色基团断裂，三苯甲烷结构被破坏，进而生成酚类或醌类小分子，实现脱色解毒。固定化酶处理后产物的毒性初步评估显示，其生态毒性低于未经处理的溴酚蓝染料溶液。
讨论与展望
该研究系统展示了以农工业残渣生产粗漆酶的可行性和游离与固定化制剂在溴酚蓝脱色中的应用潜力。研究者特别指出，直接使用粗酶制剂而非纯化酶，降低了过程复杂性和生产成本，与工程化应用目标高度契合。固定化技术赋予了酶在连续流反应器中的应用可能，有效解决了游离酶难以回收的缺陷。
固定化粗酶表现出的重复利用性和增强的操作稳定性，是本研究最突出的价值点。载体包裹可减缓外界环境扰动对酶构象的破坏，同时便于产物分离。然而，传质限制导致的底物亲和力下降，以及长期运行中酶蛋白从载体中泄漏，仍是需要进一步克服的挑战。未来研究方向可包括：开发新型功能化纳米载体以提高负载量和传质效率；优化介体循环工艺以降低化学品添加成本；利用组学技术深入解析B. adusta TMF1降解染料的代谢途径和酶基因调控网络。
此外，该研究以模拟染料溶液为对象，尚需在实际印染废水的复杂基质中验证脱色效能。实际废水中存在多种共存物质（盐、表面活性剂、重金属等），可能对酶活性产生抑制或竞争效应。因此，放大规模的连续脱色实验、高浓度染料下的工艺集成，以及脱色后处理对生物毒性的彻底消除，是该技术走向工业尾道的前置关卡。
总体而言，Ilić等人的工作为构建“农工业副产物—漆酶生产—固定化—染料脱色”的资源化利用链条提供了扎实的实验室证据。这一思路耦合了废弃物资源化与环境修复的双重目标，符合循环经济和绿色化学理念，在白腐真菌漆酶的环境生物技术应用中具有重要的启示意义。
**参考来源**
Ilić N, Lađarević J, Vasić K, Leitgeb M, Knez Ž. Decolorization of Bromophenol Blue by Free and Immobilized Crude Extracellular Laccase Preparation from *Bjerkandera adusta* TMF1 Produced on Agro-Industrial Residues. *Journal of Fungi (Basel)*, 2022. DOI: [请根据实际DOI补充]