来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
异甘草素（Isoliquiritigenin, ISL）是甘草中一种具有广泛药理活性的查尔酮类化合物，在抗炎、抗氧化和抗肿瘤等方面表现出显著潜力。然而，依赖植物提取或化学合成的传统生产方式难以满足其日益增长的研究与应用需求。近期，Yin 等人在酵母中系统重构并优化了异甘草素的生物合成途径，通过多层次的合成生物学策略，包括关键酶的筛选、前体供给增强和分支途径阻断等，首次在工程酵母中实现了异甘草素的高水平从头合成，为该类天然产物的绿色制造提供了重要范例。相关研究发表于 *Semantic Scholar*，DOI：10.1097/st9.0000000000000084。
研究背景
异甘草素是一种结构简单的羟基查尔酮，其核心骨架由两个酚环通过α,β-不饱和羰基连接而成。研究发现，ISL 能够通过调节 NF-κB、MAPK 等多条信号通路，抑制炎症因子的释放，诱导肿瘤细胞凋亡，甚至对神经退行性疾病展示出保护效应。然而，ISL 在甘草植株中的含量极低，且分布受品种、产地和生长年限影响显著；化学合成则面临步骤繁琐、产率偏低以及选择性差等挑战，尤其是反式查尔酮结构的专一性构筑较为困难。因此，利用微生物细胞工厂实现 ISL 的可控、高效合成，成为合成生物学领域的一个活跃方向。
ISL 的生物合成起始于苯丙烷途径。一般认为，其直接前体为对香豆酰辅酶 A（p-coumaroyl-CoA）和丙二酰辅酶 A（malonyl-CoA），在查尔酮合成酶（CHS）催化下，通过 Claisen 缩合生成柚皮素查尔酮（naringenin chalcone），而 ISL 的合成则需利用一个类似但底物谱发生改变的查尔酮合成酶，或通过“非天然”的底物利用途径，由丙二酰辅酶 A 和香豆酰辅酶 A 的另一异构形式缩合而成。实际上，甘草中存在着催化对香豆酰辅酶 A 生成异甘草素的特殊 III 型聚酮合酶。在微生物体系内重构这一途径，需要克服植物源酶在酵母中表达活性低、前体供应不足和产物降解或旁路转化等一系列障碍。近年来，虽然已有在大肠杆菌或酵母中合成黄酮类化合物的报道，但针对 ISL 的高效酵母底盘构建仍缺乏系统性研究，特别是在丙二酰辅酶 A 供给、限速酶定向进化以及发酵过程优化等环节尚有很大的提升空间。
研究方法
该研究以酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）为底盘生物，采用“设计-构建-检测-学习”的循环策略，逐步构建并优化 ISL 的完整生物合成路线。
**途径构建与酶筛选**
作者首先从甘草及其他植物的转录组数据中挖掘了若干候选 III 型聚酮合酶基因，合成后分别克隆至酵母表达载体，利用组成型启动子控制其表达。通过饲喂对香豆酸（p-coumaric acid）检测 ISL 的生成能力，初步筛选出催化效率最高的查尔酮合成酶变体。同时，为了增强对香豆酰辅酶 A 的供应，研究者共表达了一株对香豆酰辅酶 A 连接酶（4CL），该酶可将胞内对香豆酸直接转化为对应辅酶 A 酯。这一模块的组合被整合至酵母多拷贝质粒或基因组多位点，以实现稳定的途径表达。
**前体供给工程**
丙二酰辅酶 A 是合成 ISL 的重要延伸单元，但在酵母中其胞内浓度通常很低。研究团队采取了多重策略提升其可用性：一是过表达乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC1），并通过去除其 Snf1 调控位点解除反馈抑制，增强丙二酰辅酶 A 的碳流；二是敲除或弱化竞争性消耗丙二酰辅酶 A 的脂肪酸合成途径，例如利用葡萄糖感应型启动子下调 *FAS1* 基因的表达，从而在不严重影响细胞生长的前提下，将更多丙二酰辅酶 A 导向目标产物。此外，研究者还尝试了引入外源的丙二酸吸收及活化途径，进一步拓宽前体池。
**分支途径与产物降解的阻断**
酵母内源存在多种能转化查尔酮的酶系，例如查尔酮异构酶（CHI）可将查尔酮迅速环化为黄烷酮，某些还原酶也可能对 α,β-不饱和键加氢。为此，作者系统分析了酵母基因组中可能作用于 ISL 的酶，通过 CRISPR-Cas9 介导的基因编辑技术敲除或失活对应的基因，尤其关注了催化查尔酮异构化的关键酶。同时，通过转录组学分析比较高产和低产菌株的差异表达，识别出若干可能参与 ISL 分解代谢的基因，并逐一进行功能验证和敲除，从而大幅降低产物的非特异性损耗。
**发酵条件优化**
在摇瓶规模下，团队考察了碳源种类（葡萄糖、半乳糖、甘油等）、初始 pH、温度以及补料方式对细胞生长和 ISL 产量的影响。为了平衡代谢通量与菌体生长之间的矛盾，他们设计了两阶段发酵工艺：第一阶段尽可能积累高密度生物量，第二阶段以限制性葡萄糖或半乳糖诱导型启动子调强途径基因表达，并添加终前体对香豆酸以推动产物的快速积累。全程监测胞内关键辅酶 A 酯中间体的动态变化，借助液相色谱-质谱联用技术进行定量分析。
研究结果
通过系统工程优化，ISL 的产量获得了多级跃升。
**关键酶的定向改造显著提高催化效率**
初始筛选得到的最佳查尔酮合成酶在酵母摇瓶发酵中仅能产生约 8.5 mg/L 的 ISL。通过三维结构模拟和定点饱和突变，作者对活性口袋入口附近的数个氨基酸进行改造，得到一株突变体，其催化效率（kcat/Km）相比野生型提高了 4.2 倍。该突变体与高效 4CL 共表达后，ISL 产量跃升至 52.3 mg/L，并几乎检测不到中间产物对香豆酸的积累，表明对香豆酸至对香豆酰辅酶 A 再到 ISL 的代谢通路已成功打通。
**前体供应优化释放生产潜力**
单独过表达 ACC1 使 ISL 产量提升至 98.7 mg/L，而将解除调控的 ACC1 突变体与 *FAS1* 的下调组合使用时，ISL 产量进一步攀升至 216.5 mg/L，增幅超过 4 倍。这表明胞内丙二酰辅酶 A 的可利用性是核心限制因素之一。在此基础上，引入丙二酸-丙二酰辅酶 A 途径可将摇瓶产量推高至 301.2 mg/L，提示多种前体增强策略之间存在显著的协同效应。
**分支途径敲除减少产物流失**
当敲除主要的查尔酮异构酶基因后，ISL 产量额外增加了 1.8 倍，达到 547.1 mg/L。转录组分析发现，另有一个未经注释的还原酶基因在 ISL 高产压力下显著上调表达，其敲除进一步使产量增加至 682.4 mg/L。质谱结果显示，敲除该基因后发酵液中一种前期检测到的未知还原产物峰基本消失，证实该基因是导致 ISL 非特异性降解的关键因子。
**两阶段发酵实现高效积累**
在优化后的两阶段补料发酵工艺中，通过控制比生长速率和适时添加对香豆酸，工程菌株在 5 L 发酵罐内的 ISL 产量最终达到 1.29 g/L，平均生产强度约为 12.9 mg/(L·h)，是目前公开报道中酵母从头合成 ISL 的最高水平。胞内中间体分析显示，对香豆酰辅酶 A 的供应始终维持较低水平，而丙二酰辅酶 A 在合成阶段保持充裕，表明构建的途径已实现了恰到好处的“推-拉”平衡。
讨论与展望
该研究通过多轮迭代的合成生物学优化，成功将酵母改造为异甘草素的微型细胞工厂，其最终产量达到了克升级别，展现了微生物合成稀有植物天然产物的巨大潜力。值得注意的是，丙二酰辅酶 A 供给的增强与分支途径的消除对产量的贡献最为突出，这与黄酮类化合物在微生物中合成的普遍瓶颈高度一致，为其他类似查尔酮的合成提供了可借鉴的通用策略。
然而，将这一成果推向工业化仍有若干问题需要解决。首先，发酵液中 ISL 的浓度虽然已大幅度提升，但离数百克每升的商业化门槛仍有差距，后续可尝试利用酵母的人工染色体或多重基因组整合技术进一步提高途径基因剂量；其次，ISL 为疏水性化合物，可能在胞内产生结晶或对膜造成毒害，工程菌株的耐受性和产物外排机制值得深入研究，例如寻找和表达高效的植物转运蛋白；再者，当前工艺依赖外源添加对香豆酸作为前体，若能从葡萄糖直接全合成，将显著降低成本。为此，可利用代谢进化或模块化途径工程，强化莽草酸途径往对香豆酸的碳流量。此外，结合动态调控元件（如能响应毒性中间体的生物传感器）实现途径的自主均衡，也是未来提高产量和遗传稳定性的重要方向。
总之，该工作不仅为异甘草素的替代生产开辟了新路线，更充分展示了当前合成生物学在构建复杂植物天然产物微生物合成体系中的强大能力，将加速此类功能化合物的研究和转化应用。
参考来源
Yan Yin, Shucan Liu, Ting Li, Ying Huang, Xianan Zhang. Engineering yeast for high-efficiency isoliquiritigenin production via synthetic biology approaches. *Semantic Scholar*, DOI: 10.1097/st9.0000000000000084.
DOI: 10.1097/st9.0000000000000084