来源：Assessing the antifungal resistance of synthesized tannic acid-modified silver nanoparticles against Aspergillus niger isogenic mutants（Fungal Biology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
银纳米颗粒（AgNPs）因其广谱抗菌活性而备受关注，但其对丝状真菌的抑制机制及真菌遗传背景对敏感性的影响尚不清楚。本研究通过绿色一锅法合成单宁酸修饰的银纳米颗粒（TA-AgNPs），粒径约13.6 nm，并系统评估了其对黑曲霉野生型及五种基因缺失突变株的抑制作用。研究发现，α-葡聚糖合酶基因agsA的缺失显著增强了黑曲霉对银纳米颗粒的敏感性，为理解真菌耐药性机制和开发新型抗真菌策略提供了重要线索。
研究背景
丝状真菌在生态系统物质循环中扮演重要角色，其中黑曲霉因代谢多样性、生长迅速和高产孢子能力成为研究最深入的物种之一。黑曲霉广泛分布于土壤和腐烂有机物中，在工业上被用于酶、有机酸等代谢物的生产。然而，黑曲霉同时也是机会性病原体和食品腐败菌。传统抗真菌药物耐药性的增加及其毒性和环境影响的局限性，推动了对替代抗菌策略的探索。纳米技术作为快速发展的学科，为抗菌治疗提供了新途径。纳米颗粒（NPs）指直径在1至100纳米之间的粒子，在遗传改良、生物强化和先进灌溉系统等领域有广泛应用。
研究方法
2.1 单宁酸修饰银纳米颗粒（TA-AgNPs）的合成与表征
纳米颗粒合成使用硝酸银（AgNO₃，≥99.8%）（Fisher Scientific，Loughborough，英国）、单宁酸（C₇₆H₅₂O₄₆）（Alfa Aesar，Kandel，德国）和氢氧化钠（NaOH）（Lach-Ner，Neratovice，捷克）。AgNPs通过基于Gangwar等人（2022）方法改进的绿色一锅法合成。具体操作如下：在100 mL球形烧瓶中，将1000 mg单宁酸（TA）和100 mg NaOH溶解于25 mL双蒸水（dd H₂O）中。待TA和NaOH完全溶解后（约搅拌10分钟），将AgNO₃水溶液（500 mg溶解于2.5 mL dd H₂O中）逐滴加入反应介质中。溶液颜色由黄色变为棕色，表明AgNPs形成。搅拌5分钟后，再加入25 mL dd H₂O，剧烈搅拌10分钟。反应完成后，将NPs溶液分装至2.0 mL离心管中，以最大相对离心力（rcf）24 × 3.4g离心2分钟。沉淀用dd H₂O重悬后再次离心，直至上清液澄清。最终沉淀收集并分散于dd H₂O中，银的最终浓度为10.81 mg/mL。
AgNPs的形成由AgNO₃加入TA碱性溶液引发，表现为深棕色出现。在碱性条件下，TA的酚基通过儿茶酚基团的转化部分氧化为醌。同时，AgNO₃中的Ag⁺离子被还原为元素银（Ag⁰）。这一氧化还原过程触发成核及随后的AgNPs生长。TA的氧化形式随后通过羰基和羟基吸附在Ag⁰ NPs表面，稳定胶体分散体并防止团聚。所得TA-AgNPs以稳定的棕色溶液形式悬浮。整体反应机理如图1所示。
纳米颗粒在dd H₂O中的流体动力学直径（dH）和Zeta电位（ζ）通过动态光散射（DLS）测量，使用Malvern Instruments Zetasizer Nano Series（配备多用途滴定器，He-Ne激光633 nm）。纳米颗粒在紫外-可见（UV-Vis）区域的吸收光谱使用Shimadzu UV-2600i UV-Vis分光光度计在300-700 nm波长范围内采集。傅里叶变换红外（FT-IR）光谱使用Shimadzu IRAffinity-1光谱仪（QATR 10单反射ATR金刚石附件）获取，扫描范围4000-400 cm⁻¹。透射电子显微镜（TEM）分析使用JEM-1010（JEOL，东京，日本），配备MegaView III高分辨率数码相机和JEOL成像软件。粉末X射线衍射（pXRD）图谱使用Brucker D8 Advance衍射仪（40 kV电压，25 mA电流）获得，X射线照射使用Cu阳极（λ = 1.5415 Å）。
【数据】AgNO₃用量：500 mg/2.5 mL dd H₂O；TA用量：1000 mg；NaOH用量：100 mg；dd H₂O体积：25 mL + 25 mL；离心：24 × 3.4g，2 min；银终浓度：10.81 mg/mL；DLS激光：633 nm；UV-Vis范围：300-700 nm；FT-IR范围：4000-400 cm⁻¹；pXRD：40 kV，25 mA，Cu阳极λ = 1.5415 Å
2.2 真菌培养与制备
本研究使用的所有菌株均属于黑曲霉，源自亲本菌株N402，该菌株最初在乌得勒支真菌遗传学实验室开发（van Leeuwe等，2020）。命名遵循MycoBank中列出的当前公认分类学。黑曲霉野生型（N402）和突变株（TLF39、TLF93、TLF96、TLF95、MA2.34）在完全培养基（CM）中于25°C培养7天，这是这些突变株的最适温度（van Leeuwe等，2020；Van Munster等，2015）。本研究使用的所有黑曲霉突变株均源自同一亲本菌株，携带共同的kusA基因缺失（ΔkusA::DR-amdS-DR），该缺失促进同源重组和靶向基因破坏。此外，还引入了与细胞壁完整性和α-葡聚糖生物合成相关的基因缺失，包括crhA-G基因家族成员以及agsA和agsE基因。crh基因编码参与细胞壁交联的糖基转移酶，而agsA和agsE基因编码对α-葡聚糖生产至关重要的α-葡聚糖合酶。不同突变株中这些缺失的组合使得能够比较分析它们对化学合成银纳米颗粒（AgNPs）的敏感性和适应性反应。
制备500 mL CM培养基时，将以下组分混合：10 mL ASP+N 50×储备液（由KCl、KH₂PO₄、NaNO₃组成，用1 M NaOH或HCl将pH调至5.5）、10 mL葡萄糖（Fisher Scientific，Loughborough，英国）50%（w/v）、1 mL 1 M MgSO₄（Merck，Darmstadt，德国）、0.5 mL VN微量元素溶液（由EDTA和ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·5H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、CaCl₂·2H₂O、FeSO₄·7H₂O组成）、0.5 g酪蛋白氨基酸（VWR Chemicals，俄亥俄州，美国）、2.5 g酵母提取物（Fisher Scientific，Loughborough，英国）和7.5 g琼脂（Chembiotin，雅典，希腊）（用于固体培养基）。最终体积用软化水调至500 mL，培养基在121°C高压灭菌20分钟。黑曲霉孢子收集后通过离心纯化（RCF = 8.39 × 10²g），重复两次。孢子悬浮液进行系列十进制稀释，以获得10 μL接种物中含100个分生孢子，通过血球计数器计数（Gizaw等，2024）。
【数据】培养温度：25°C；培养时间：7天；CM培养基pH：5.5；高压灭菌：121°C，20 min；孢子离心：RCF = 8.39 × 10²g，2次；接种量：10 μL含100个分生孢子
2.3 银纳米颗粒浸渍琼脂平板的制备
将银纳米颗粒（AgNPs）合成后掺入生长培养基中制备AgNPs浸渍琼脂平板。纳米颗粒首先分散在无菌蒸馏水中并超声处理以实现均匀分散，然后以0、30、60、90和120 ppm的浓度加入熔化的完全培养基（CM）中。混合物持续搅拌以确保均匀分布，然后在无菌条件下倒入无菌培养皿中。平板在室温下凝固后进行真菌接种。
【数据】AgNPs浓度：0、30、60、90、120 ppm；培养基：完全培养基（CM）
2.4 真菌菌株与接种物制备
本研究使用前述黑曲霉菌株（表1），包括野生型（N402）和五种各自缺失特定细胞壁合成相关基因的突变株。孢子悬浮液通过在25°C CM琼脂上生长7天的成熟真菌培养物轻轻刮取制备。收获的孢子悬浮在0.1%（v/v）Tween-80溶液中，涡旋以实现均匀性，并通过无菌纱布过滤以去除菌丝碎片。使用血球计数器将孢子浓度调整为10⁴分生孢子/mL，以确保所有实验的接种物标准化。
【数据】孢子悬浮液：0.1%（v/v）Tween-80；孢子浓度：10⁴分生孢子/mL；培养：25°C，7天
2.5 真菌生长测定
每个AgNPs浸渍平板中心接种5 μL标准化孢子悬浮液。平板在25°C、受控湿度下培养至少10天，每天监测。每种黑曲霉突变株在四种不同AgNPs浓度下测试：30 ppm、60 ppm、100 ppm和120 ppm。实验设置三次重复以确保可重复性。菌落直径按照先前描述的方案（Sardella等，2019），在频繁时间间隔下沿两个垂直轴测量两次。计算AgNPs处理和对照真菌培养物的生长速率，并通过比较处理和未处理菌落的扩展速率来确定生长潜力。
【数据】接种量：5 μL孢子悬浮液；培养温度：25°C；培养时间：≥10天；AgNPs测试浓度：30、60、100、120 ppm；重复：3次
2.6 动力学评估与数据分析
通过线性回归分析将真菌菌落直径与培养时间相关联来估计生长速率，从而分析AgNPs的抑制效果。随后计算“待完成工作量”（work to be done）参数。
【数据】分析方法：线性回归分析
研究结果
3.1 AgNPs的结构与形态表征
单宁酸还原银纳米颗粒（TA-AgNPs）的胶体悬浮液显示平均流体动力学直径（dH）在5.7至11.1 nm之间，多分散指数（PDI）为0.500（图S1A），表明相对单分散分布且团聚倾向低。Zeta电位（ζ）值为−22.4 mV（图S1B），表明纳米颗粒具有中等静电稳定性。UV-Vis光谱在420 nm处呈现明显的表面等离子体共振峰（图S2），确认了AgNPs的成功形成。纯单宁酸的FTIR光谱（图S3）在3286 cm⁻¹处显示强O-H伸缩振动，在600-1700 cm⁻¹范围内显示特征芳香族C-C和C-O伸缩带。在TA-AgNPs光谱中，这些峰显示出强度降低和轻微位移，表明单宁酸的酚羟基与银离子在还原过程中发生结合（Bhattacharjee，2016；Xu，2008）。尽管单宁酸的特征FTIR峰在TA-AgNPs光谱中未清晰观察到，但单宁酸在纳米颗粒合成中发挥关键作用。单宁酸的酚羟基可将Ag⁺离子还原为金属Ag⁰，而其多酚结构允许通过含氧官能团与银原子之间的相互作用吸附到纳米颗粒表面（Gangwar等，2022；Hasan等，2022）。这些相互作用可能改变酚基的振动环境，导致FTIR光谱中峰位移、变宽或重叠，这使得单宁酸的特征带在纳米颗粒形成后不太容易区分（Dhaka等，2023）。然而，吸附在纳米颗粒表面的单宁酸分子作为封端和稳定剂，防止聚集并有助于合成TA-AgNPs的胶体稳定性（Kareem等，2025）。
TEM分析（图2）显示TA-AgNPs主要为球形、分散良好、轻度聚集，粒径比DLS测量值小。
粉末X射线衍射（pXRD）图谱（图S4）在2θ值38.2°、44.2°、64.4°和77.5°处显示四个不同的衍射峰，分别对应晶体银的（111）、（200）、（220）和（311）晶面。这些反射确认了金属Ag的面心立方（fcc）结构。通过Scherrer方程计算的平均微晶尺寸约为7.37 nm。表2总结了DLS、TEM和pXRD获得的比较结果，确认了TA-AgNPs的纳米尺寸和结晶性质。
【数据】dH：5.7-11.1 nm；PDI：0.500；Zeta电位：−22.4 mV；UV-Vis峰：420 nm；FT-IR峰：3286 cm⁻¹（O-H），600-1700 cm⁻¹（C-C/C-O）；pXRD峰：38.2°、44.2°、64.4°、77.5°；平均微晶尺寸：7.37 nm
3.2 黑曲霉突变株的生长动力学
通过估计生长参数（包括最大比生长速率（μ_max）和延滞期持续时间（λ））评估TA-AgNPs对黑曲霉野生型和突变株生长行为的影响，涵盖不同纳米颗粒浓度（图3和图4）。
突变株间的统计比较显示，agsA基因缺失导致对AgNPs的敏感性显著高于crhA-G基因家族缺失。具体而言，TLF96突变株（ΔkusA::DR-amdS-DR，ΔcrhA-G，ΔagsA）和TLF39突变株（ΔkusA::DR-amdS-DR，ΔcrhA-G）在纳米颗粒暴露下表现出不同的适应性行为（van Leeuwe等，2020）。突变株在μ_max和延滞期方面随浓度呈现变异性，其中TLF93在120 ppm AgNPs下显示最高μ_max，TLF39显示最低，如图3（μ_max）和图4（λ）所示，图中包含相应的统计分析。
“待完成工作量”参数定义为μ_max和λ的乘积，TLF96和TLF39最低（图5），表明在含AgNPs环境中具有更高的生长速率和更短的适应期。
这些结果表明某些突变株拥有应对银诱导胁迫的增强生理机制。然而，显微镜检查揭示这些明显的生长优势伴随着显著的形态变化。SEM分析（图6和图7）显示，野生型菌株N402在AgNPs暴露后表现出中等程度的表面皱缩，无明显菌丝破裂；而TLF96等突变株则表现出严重的膜塌陷、孔形成和表面破坏。
在K200 μm尺度下，对照和处理样品的分生孢子密度相当，表明AgNPs暴露未显著降低总体分生孢子群体。在10 μm尺度下，两种条件下的菌丝均显得相对宽阔；然而在处理样品中，菌丝表面显示出明显的皱缩，但未观察到结构的显著断裂或塌陷。在5 μm尺度下，处理样品中检测到类似的表面皱缩，但没有膜破裂的证据。这些发现表明，缺乏主要细胞壁相关基因缺失的野生型N402保持结构稳健性，在AgNPs暴露后仅表现出中等程度的形态改变。
【数据】AgNPs浓度：30、60、90、120 ppm；TLF93最高μ_max：120 ppm；TLF39最低μ_max：120 ppm；TLF96和TLF39的“待完成工作量”值最低；N402：中等表面皱缩，无显著菌丝破裂；TLF96：严重膜塌陷、孔形成
讨论与解读
全面的理化表征证实，单宁酸在AgNPs合成中有效发挥还原剂和稳定剂的双重功能，产生具有高稳定性和明确纳米尺寸的纳米颗粒。需要澄清的是，本研究并非将单宁酸负载到预先形成的纳米颗粒上，而是单宁酸直接参与银离子的还原和纳米颗粒合成过程中的稳定化，作为形成过程的一部分与纳米颗粒表面结合。−22.4 mV的Zeta电位支持足够的胶体稳定性，FTIR数据突出了单宁酸与银表面之间的化学相互作用（Bhattacharjee，2016；Xu，2008）。DLS、TEM和pXRD分析之间的一致性加强了纳米颗粒合成方法的可靠性和可重复性（Bhattacharjee，2016）。这些发现支持单宁酸介导的合成作为生产生物活性银纳米颗粒的稳定且环境友好的策略。
在理化表征之外，本研究为真菌对银纳米颗粒抗性的遗传决定因素提供了新见解。通过比较具有细胞壁相关基因靶向缺失的多种黑曲霉突变株，证明α-葡聚糖合酶在保护真菌细胞免受纳米颗粒诱导胁迫中发挥关键作用。TLF96突变株（同时缺失crhA-G和agsA）比TLF39（仅缺失crhA-G）对化学合成银纳米颗粒更敏感，表明agsA基因的缺失通过损害α-葡聚糖介导的细胞壁完整性而增加黑曲霉的敏感性。
编译者解读
本研究采用绿色一锅法合成TA-AgNPs，方法简洁且环境友好，单宁酸兼具还原与稳定双重角色，省去了额外稳定剂的使用。从合成生物学应用角度看，利用同源突变株库系统解析真菌耐药性遗传基础，是值得借鉴的研究范式——通过精确的基因缺失组合定位关键耐药靶点（如agsA基因），为设计针对真菌细胞壁合成的抗菌策略提供了明确方向。本研究的局限在于仅评估了单一纳米颗粒体系，且体外实验与体内应用场景仍有距离。未来可考虑将TA-AgNPs与CRISPR基因编辑技术结合，在工业菌株中定向改造细胞壁合成通路，以实现生产性能与抗逆性的协同优化。
参考来源
Avdala K. Assessing the antifungal resistance of synthesized tannic acid-modified silver nanoparticles against Aspergillus niger isogenic mutants. Fungal Biology, 2026. DOI: 10.1016/j.funbio.2026.101769
DOI: 10.1016/j.funbio.2026.101769