来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
多糖作为高等真菌的关键活性成分，在医药、功能食品及生物材料领域展现出巨大潜力。然而，如何从野生菌株的菌丝体培养物中实现多糖的高效生产与精准分离，仍是制约其深度开发利用的瓶颈。Miona Miljković 等人在《Journal on Processing and Energy in Agriculture》发表的最新研究，首次从多株自然生境分离的高等真菌出发，系统建立了菌丝体深层发酵、多糖提取与分级纯化的完整技术路线，并揭示了不同分离株在多糖产量、单糖组成及分子量分布上的显著差异。该工作不仅为真菌多糖的标准化制备提供了可靠模型，更突显了天然种质资源在合成生物学底盘筛选中的重要价值。
研究背景
高等真菌（特别是担子菌和子囊菌）在长期进化中形成了丰富的次生代谢途径，其菌丝体及子实体中积累的β-葡聚糖、杂多糖及糖蛋白复合物，已被证实具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化及肠道菌群调控等多重生物活性。与植物和藻类多糖相比，真菌多糖往往具有更高的分支度和独特的糖苷键类型，这些结构特征直接决定了其与模式识别受体（如Dectin-1、TLR）的识别特异性。然而，野生子实体采集受季节、地域限制，且化学成分批次差异极大，而菌丝体深层发酵则可在控温、控氧条件下实现多糖的恒定生产，成为工业化开发的首选路径。
目前，真菌菌丝体多糖的研究多集中于灵芝、云芝、香菇等经典药食两用菌的驯化菌株，对自然界中未经强化的野生分离株关注较少。事实上，同一物种的不同生态型在次生代谢产物谱上可能存在巨大分化，这为挖掘结构新颖、活性更强的多糖分子提供了天然筛选库。此外，已有的多糖提取纯化流程往往忽视菌丝体细胞壁的高机械强度，导致破壁不充分、多糖释放率偏低；后续的分离步骤也常因分级不够精细，使不同分子量、带电荷差异的多糖组分混杂，影响构效关系解析的可靠性。
针对上述问题，Miljković 团队从塞尔维亚不同森林生态系统的朽木与土壤中分离获得多株高等真菌，经形态学和分子鉴定后，评估了其菌丝体在摇瓶和发酵罐水平的生长特性，进而运用热碱联合提取、逐步醇沉与阴离子交换色谱的组合策略，系统比较了各分离株菌丝体多糖的产率、纯度及初级结构参数。这一研究范式将天然种质资源挖掘与过程工程优化紧密结合，为未来基于合成生物学的底盘改造和多糖异源合成奠定了原料与数据基础。
研究方法
研究的技术路线可归纳为“野外分离—菌种鉴定—深层发酵—破壁提取—分级纯化—组分表征”六个递进模块，各模块方法的选择均以提升多糖回收率和结构完整性为导向。
首先，团队自塞尔维亚境内阔叶林朽木和腐殖质层中采集子实体或菌丝束标本，采用组织分离法获取纯培养菌丝体。为精确界定分类学地位，研究者扩增了核糖体DNA内转录间隔区（ITS）序列，并基于邻接法构建系统发育树，将分离株鉴定至属乃至种水平。最终纳入深入研究的菌株涵盖栓菌属、原毛平革菌属、侧耳属等多个类群，显示出较高的物种多样性。
发酵工艺方面，所有菌株均先在马铃薯葡萄糖琼脂平板上活化，随后转接至含酵母提取物、麦芽提取物和葡萄糖的液体种子培养基，于 25 ℃、150 rpm条件下培养 7 天。大规模多糖生产采用带有挡板的三角瓶进行深层发酵，工作体积 200 mL，接种量 10%（v/v），培养温度、转速和初始pH分别设定为 28 ℃、180 rpm 和 5.5。发酵周期持续 14 天，期间每隔 24 小时取样监测生物量（以干重计）、残糖浓度及胞外多糖分泌量，以确定最佳采收时间。发酵结束时，菌丝体经 8000 × g 离心收集，去离子水充分洗涤后冷冻干燥，获得菌丝体冻干粉。
多糖提取采用“加热破壁—碱液增溶”双效联用方案。冻干菌丝体先经机械研磨过 60 目筛，按 1:30（w/v）的料液比悬浮于 2% NaOH 溶液中，在 80 ℃水浴中持续搅拌提取 4 小时。碱液可有效断裂细胞壁中几丁质-β-葡聚糖复合体间的氢键及酯键，促使不溶性多糖向可溶态转化。提取液冷却后以 1 mol/L HCl 中和至 pH 7.0，离心去除细胞碎片。上清液采用 Sevag 法（氯仿:正丁醇 = 4:1）反复脱蛋白 3 次，直至水相与有机相界面无明显变性蛋白层。脱蛋白后的多糖溶液经旋转蒸发浓缩至原体积的 1/5，随后加入 4 倍体积 95% 冷乙醇，4 ℃ 静置过夜。次日离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥即得粗多糖。
粗多糖的精细分级依托阴离子交换色谱完成。将 1 g 粗多糖溶于 20 mL 去离子水，上样至 DEAE-Sepharose Fast Flow 色谱柱（2.6 × 30 cm），依次以去离子水、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 溶液进行阶段洗脱，流速控制在 2 mL/min，每管收集 10 mL。以苯酚-硫酸法跟踪糖含量，合并各洗脱峰组分，透析除盐后冻干。最终获得的不同多糖亚组分随后采用高效凝胶渗透色谱测定分子量分布，柱前衍生化反相高效液相色谱分析单糖组成，并通过傅里叶变换红外光谱鉴定糖苷键构型及官能团特征。
研究结果
研究获得了多维度的数据，全面揭示了不同高等真菌天然分离株在多糖生产能力和结构特征上的差异。
在生物量积累方面，各菌株的菌丝体干重呈现显著差别：白腐菌类菌株的生物量普遍高于褐腐菌株，其中一株栓菌属分离株（Trametes sp. K1）在发酵终点时菌丝体干重高达 18.2 g/L，而一株原毛平革菌属分离株仅为 9.6 g/L。培养基中还原糖的消耗曲线与生物量增长高度吻合，发酵至第 10 天时残糖浓度即降至 2 g/L 以下，表明碳源利用充分。值得注意的是，胞外多糖分泌量并未与生物量线性相关，最高胞外多糖产量（3.4 g/L）出现于一株侧耳属分离株，推测其具有更强的荚膜多糖分泌系统。
粗多糖产率方面，碱提法在所有菌株中均显著优于水提对照。以 Trametes sp. K1 为例，水提粗多糖得率仅 4.8% 菌丝体干重，而碱提得率跃升至 12.3%。经 Sevag 脱蛋白和醇沉后，粗多糖中总糖含量由 45%～62% 提升至 78%～86%，蛋白残留量低于 2%，表明纯化操作有效去除了大部分共沉淀的菌丝体蛋白。不同菌株间的粗多糖得率差异可达三倍以上，这一发现有力支撑了“菌株选择是多糖生产首要变量”的观点。
离子交换色谱分级揭示了每种粗多糖均由多个荷电性质不同的亚组分构成。大多数菌株的中性多糖组分（水洗脱峰）占比在 25%～50% 之间，其分子量集中在 1×10⁶ Da 附近，呈现较窄的单峰分布；而酸性多糖组分（0.3 mol/L NaCl 洗脱峰）则显示出更宽的分子量范围（5×10⁴ 至 2×10⁶ Da），且分支度更高。单糖组成分析表明，中性组分以葡萄糖为主（摩尔比超过 80%），伴有少量半乳糖和甘露糖；酸性组分则明显富含葡萄糖醛酸和木糖，意味着可能存在以木糖-葡萄糖醛酸为主链的酸性杂多糖结构。红外光谱在 890 cm⁻¹ 附近的特征吸收证实了中性组分中 β-糖苷键的优势构型，而 1730 cm⁻¹ 附近的酯羰基峰和 1620 cm⁻¹ 的羧基峰则出现在酸性组分中，与单糖分析结果互为印证。
特别引人关注的是，来源于同一生态区但不同宿主的同属分离株之间，多糖的单糖组成也表现出种内差异。例如，Trametes sp. K1 的酸性多糖中葡萄糖醛酸含量高达 18.6 mol%，而 Trametes sp. K5 仅为 11.2 mol%，这一结构性变化可能直接影响其与免疫细胞的亲和力。这些结果清晰地表明，除物种因素外，微生境和基质特异性也可能驱动真菌多糖的结构微调，为“通过生态因子定向富集目标多糖”提供了初步线索。
讨论与展望
该研究通过全链条的实验设计，系统评估了野生高等真菌天然分离株作为多糖生产宿主的可行性。发现菌株间的多糖产率差异远比同一菌株在不同培养基条件下的波动更为显著，这再次强调了在利用真菌底盘进行产物合成时，种质资源广谱筛选的不可或缺性。碱液提取联合阴离子交换分级的方法学组合，能够有效解构菌丝体细胞壁中各类多糖的相互作用，得到电荷和分子量均一度较高的亚组分，为后续的核磁共振精细结构解析和生物活性测试奠定了物质基础。
本文的另一亮点在于将生态学的“生境-代谢”关联思维引入了真菌多糖研究。不同分离株酸性多糖中糖醛酸含量的显著分化，暗示宿主木材的化学组成（如木质素类型、半纤维素构成）可能通过菌丝体胞外酶系的诱导表达，间接影响了细胞壁多糖的修饰程度。未来若能将宏基因组学、培养组学与靶向代谢组学相结合，或可解码特定生态位中真菌多糖结构的形成规律，进而实现 “以环境为反应器”的定制化多糖生产。
然而，研究也有待深化之处：首先，虽然菌丝体发酵采用了摇瓶体系，但缺乏放大至生物反应器时的传质和剪切力影响评估；其次，多糖的生物活性评价仅停留于初步的自由基清除实验，未涉及细胞或动物模型，目前仍难以构建清晰的结构-活性关系。后续工作应聚焦于整合合成生物学工具——如在高效分离株中过表达或敲除葡聚糖合酶基因，验证关键糖基转移酶在分支结构形成中的作用，进而使多糖结构朝着高活性方向优化。可以预见，随着天然分离株资源库的扩充与分子操作体系的成熟，高等真菌菌丝体多糖的理性设计生产将逐步从概念走向现实。
参考来源
> Miljković M, Davidović S, Ilić N. Production and isolation of polysaccharides from mycelia of natural isolates of higher fungi. *Journal on Processing and Energy in Agriculture*, DOI: 10.5937/jpea30-65359. （注：原文数据源自对该论文的系统解读。）
DOI: 10.5937/jpea30-65359