来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
微生物源多铜氧化酶在环境修复、绿色化工等领域展现出巨大应用潜力。本研究从农场生物净化系统的基质中分离出一株苍白杆菌（*Ochrobactrum* sp.）BF15，并首次发现其携带一个编码新型漆酶样多铜氧化酶（Lac-BF15）的质粒。该酶在异源表达后表现出宽泛的底物谱和显著的有机溶剂耐受性，不仅为质粒介导的氧化酶水平转移提供了直接证据，也为利用廉价宿主生产工业用漆酶开辟了新途径。相关成果发表于 *Food Technology and Biotechnology*。
研究背景
漆酶（laccase）属于多铜氧化酶家族，能够催化多种酚类和非酚类化合物的氧化，同时将分子氧还原为水，因而在纸浆漂白、纺织染料脱色、生物传感器及环境污染物降解等领域备受青睐。长期以来，真菌漆酶因氧化还原电位高、底物范围广而被广泛研究，但真菌酶的热稳定性和异源表达效率常难以满足工业需求。相比之下，细菌来源的漆酶样多铜氧化酶在碱性和高盐条件下的稳定性更优，且更易于通过重组DNA技术实现规模化生产。然而，已鉴定的细菌漆酶种类依然有限，新酶的发掘主要依赖于功能宏基因组学或可培养菌株的筛选。
值得注意的是，氧化酶基因在细菌间的水平转移可能是微生物快速获得环境适应能力的重要机制。已有个别报道指出漆酶基因定位于可移动遗传元件上，但对其在原核生物中的分布规律、传播方式及生化功能仍缺乏系统认知。农场生物净化系统（on-farm bio-purification system）是用于处理农药冲洗废水的简单生物反应器，其中的微生物群落长期暴露于高浓度农药及其他异生物质，极有可能蕴藏新颖的氧化酶基因资源。基于此，本研究以该特殊生境中的可培养细菌为对象，寻找新型质粒编码的多铜氧化酶，并深入解析其酶学特性与潜在应用价值。
研究方法
研究团队首先从农场生物净化系统的基质中采集样品，通过含铜离子、丁香醛连氮等漆酶诱导底物的富集培养基，分离具备氧化酶活性的细菌。经过显色筛选，获得一株能在含有2,2\'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）和愈创木酚的平板上产生特征性显色圈的菌株，命名为BF15。通过16S rRNA基因测序与系统发育分析，将BF15鉴定为苍白杆菌属成员。随后，提取该菌株的总基因组DNA及质粒DNA，利用质粒固化实验和聚合酶链式反应确证漆酶活性与质粒的关联。进一步对质粒进行全序测定和开放阅读框预测，锁定一个编码多铜氧化酶的基因，并命名为*lac-BF15*。生物信息学分析涵盖多序列比对、保守铜结合域鉴定和系统发育树构建，以明确该酶在细菌多铜氧化酶家族中的分类位置。
为获取纯酶并研究其性质，将*lac-BF15*基因克隆至pET表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达。重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后，用于生化表征。以ABTS、丁香醛连氮、2,6-二甲氧基苯酚（DMP）和左旋多巴（L-DOPA）等模式底物测定酶活力及动力学参数。同时考察温度、pH对酶活性的影响，并评估其对有机溶剂、金属离子、抑制剂和盐离子的耐受性。此外，测试了重组酶对多种合成染料（如刚果红、活性黑5、靛蓝胭脂红）的脱色能力，以评估其潜在应用性能。
研究结果
分离得到的苍白杆菌BF15在含有铜离子的平板上表现出明显的漆酶样活性。质粒提取和电泳分析证明其含有一个约30 kb的质粒，将该质粒消除后菌株的氧化活性完全丧失，暗示活性可能完全由质粒编码。全质粒测序后，发现一个长1 170 bp的开放阅读框，其推导蛋白（389个氨基酸）包含多铜氧化酶特征性的T1铜、T2铜和T3铜结合基序，且与已报道的细菌漆酶样多铜氧化酶序列相似度在50%~65%之间。系统发育分析显示，Lac-BF15与来源于苍白杆菌属及其他α-变形菌的多铜氧化酶聚类，但又形成相对独立的分支，表明其具有新颖性。
重组Lac-BF15在pH 6.0~8.0范围内呈现出较高活性，最适pH在ABTS和丁香醛连氮底物下分别为4.5和6.5，且在碱性条件下仍保持50%以上活性。最适温度为55°C，但40~70°C之间皆可维持60%以上相对活力。热稳定性实验显示，50°C孵育2小时后仍保留约70%活性，而60°C下半衰期约为30分钟，体现了中等的热稳定性。动力学分析表明，该酶对ABTS的催化效率最高（*k*/cat/*K*/m = 5.8 × 10⁵ s⁻¹·M⁻¹），对丁香醛连氮和DMP的亲和力与催化效率次之，而对左旋多巴的活力较弱。
尤为突出的是，Lac-BF15对多种有机溶剂展现出优异的耐受性：在体积分数为30%的甲醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜存在下孵育24小时后，仍可保留80%以上的活性；在50%甘醇中也表现出较好的相容性。金属离子方面，1 mM Cu²⁺可轻微激活酶活力（约提升10%～20%），而Mg²⁺、Ca²⁺等则无明显影响；经典漆酶抑制剂如NaN₃和EDTA能够显著抑制活性。此外，酶在0~500 mM NaCl浓度范围内保持稳定，提示其在高盐环境下的应用潜能。
应用评估显示，纯化后的重组酶对多种合成染料均具有脱色能力。在添加ABTS作为介体的条件下，24小时内对靛蓝胭脂红和活性黑5的脱色率分别超过85%和70%，对刚果红脱色率达50%以上。即使不添加氧化还原介体，对部分染料的直接脱色仍不可忽视，证实该酶具有较宽的底物谱和潜在的污染物降解能力。
讨论与展望
本研究首次报道了苍白杆菌属中由质粒编码的漆酶样多铜氧化酶，不仅拓展了人们对细菌漆酶基因环境来源的认知，还为理解α-变形菌中氧化酶的水平转移提供了明确的遗传学证据。质粒携带的特性意味着该功能基因具有通过接合、转化等方式在群落中快速扩散的潜力，可能在含有大量异生物质的生物净化系统中发挥关键的生态学功能，协助微生物群落应对氧化胁迫和难降解有机物。
在应用层面，Lac-BF15综合了多项有利特征：宽泛的pH作用范围、较高的热稳定性、对常见有机溶剂的较强耐受性以及染料脱色能力，使其具备了作为工业用生物催化剂的潜质。特别是有机溶剂耐受性暗示该酶在非水相催化系统或含溶剂的工业废液处理场景中前景可观。未来的工作应着力于定向进化或半理性设计以提高酶的热稳定性和氧化还原电位，扩大对高氧化还原电势的非酚类底物的催化能力。同时，利用该酶质粒载体的天然特性，或许可以在不同的低本底宿主中直接构建功能菌剂，用于原位生物修复。
随着宏基因组和可培养组技术的融合，预计将有更多特殊环境中质粒编码的新颖氧化酶被发掘。本研究建立的技术路线——从活性筛选到质粒功能验证再到重组表征——为后续从复杂微生物组中快速锁定可移动氧化酶基因提供了可借鉴的范例。
参考来源
Martini M.C., Berini F., Ausec L., Casciello C., Vacca C. Identification and Characterization of a Novel Plasmid-Encoded Laccase-Like Multicopper Oxidase from *Ochrobactrum* sp. BF15 Isolated from an On-Farm Bio-Purification System. *Food Technology and Biotechnology*, 59(4): 7253. DOI: 10.17113/ftb.59.04.21.7253.
DOI: 10.17113/ftb.59.04.21.7253