来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
漆酶作为一种多功能绿色催化剂，在环境修复、生物能源与绿色合成等领域备受青睐，但其工业应用常受限于高昂的生产成本和苛刻的表达体系。近期一项研究独辟蹊径，利用一株原本嗜酸生长的绿色微藻——*Chlamydomonas pitschmannii*，通过将培养环境从酸性“切换”至碱性，首次实现了真正漆酶的高效胞外分泌。这一突破不仅为漆酶的可持续生产提供了全新的光合平台，更展现了一种“以碱激酶”的独特调控逻辑，为微藻绿色生物制造的底盘开发拓宽了边界。
研究背景
漆酶（laccase, EC 1.10.3.2）属于多铜氧化酶家族，能够利用空气中的氧气氧化多种酚类及非酚类底物，仅生成水作为副产物，被视为理想的“绿色催化剂”。传统漆酶主要来源于真菌，其异源表达常依赖毕赤酵母或丝状真菌系统，但培养成本高、周期长，且易出现糖基化不均等问题。近年来，光合微藻作为“光能驱动”的细胞工厂逐渐兴起，其培养简单、不依赖有机碳源、可利用CO₂的特点，使重组蛋白的低碳生产成为可能。然而，以莱茵衣藻（*Chlamydomonas reinhardtii*）为代表的模式藻种在分泌外源蛋白方面效率偏低，且多用于表达胞内或周质空间定位的蛋白，真正实现漆酶高效分泌的报道寥寥无几。
更为关键的是，许多来自细菌或植物的漆酶在异源表达时活性低下，或实为“类漆酶”（如多铜氧化酶），无法具备真正漆酶所特有的高氧化还原电势和宽底物谱。因此，寻找既能高效分泌又能正确折叠的真漆酶表达宿主，是该领域的重要课题。*Chlamydomonas pitschmannii* 是一株分离自酸性矿坑水的嗜酸绿藻，其天然栖息环境的极端pH条件暗示其具备独特的离子与蛋白转运机制。此前该藻已被开发为重组蛋白表达宿主，但在酸性培养条件下，外源蛋白的分泌水平并不理想。研究团队跳出惯性思维——既然低pH可能抑制胞外蛋白稳定性或分泌通路，那么将嗜酸藻“碱处理”能否激活其高效分泌潜能？这一反向操作成为了本研究的核心假设。
研究方法
研究团队以来自*Streptomyces coelicolor*的一株小型真漆酶（SLAC）为报告蛋白，该酶此前已在莱茵衣藻中实现胞内表达，但分泌效果不佳。实验路线自下而上分四步走：
**1. 表达载体构建与密码子优化**
针对*C. pitschmannii*的核基因组密码子偏好性，对SLAC编码序列进行全基因合成并优化，含藻类偏好偏倚。在N端融合了源自该藻内源分泌蛋白的信号肽，以引导共翻译易位进入内质网-高尔基体分泌路径，并在C端添加6×His标签便于免疫学检测与纯化。表达盒由强启动子HSP70A-RBCS2嵌合启动子驱动，以赋予高效的组成型转录。
**2. 核转化与高分泌株筛选**
采用电穿孔法将线性化表达载体导入*C. pitschmannii*细胞，利用博来霉素抗性基因进行筛选。通过抗生素平板初筛后，挑取单克隆接种至酸性TAP培养基（pH 4.5）中，再利用深层孔板在酸性和碱性培养基中平行初筛，以胞外漆酶活性为导向挑选出在碱性条件下酶活显著提升的株系。最终获得遗传稳定、分泌表型突出的工程株P25。
**3. 酸碱切换培养策略**
工程株首先在酸性培养基（pH 4.5）中扩培至对数中期，此时藻细胞生长良好但漆酶分泌量极低。随后收集藻细胞并等量转移至新鲜碱性TAP培养基（pH 8.0）中，继续培养48–72小时。这一“酸性生长-碱性分泌”的两阶段策略，既利用了嗜酸藻在酸性条件下的快速倍增特性以积累生物量，又借助碱性环境激活分泌系统，同步实现高密度和高产出。培养结束后离心收集上清，经浓缩和镍亲和层析获纯酶。
**4. 漆酶酶学性质表征**
以ABTS、丁香醛连氮等经典底物进行酶活测定；分析最适pH、温度及稳定性；通过光谱学手段确认铜离子负载状态；并利用质谱鉴定纯化蛋白的分子量和肽图谱，证实SLAC蛋白以成熟形式被正确加工和分泌。同时还检测了碱性条件下藻细胞活力、膜完整性及胞内蛋白泄漏情况，以排除细胞裂解导致的“假分泌”。
研究结果
研究获得了令人振奋的分泌效率。在酸性条件（pH 4.5）下，工程株P25的胞外漆酶活性仅为0.12 U·mL⁻¹，而切换至碱性条件（pH 8.0）72小时后，胞外活性骤升至12.8 U·mL⁻¹，提高了逾100倍。蛋白定量分析显示，纯化后SLAC产量达到**18.6 mg·L⁻¹**，占胞外总蛋白的显著比例，且以可溶性单体形式存在，未发生明显降解或聚沉。这一分泌水平在目前微藻表达系统中属于绝对前列，甚至可与部分酵母体系相媲美，同时培养过程仅需光照、空气和简单无机盐，不添加任何诱导剂。
对纯化酶的系统表征证实了其“真漆酶”身份。该酶具有典型的铜蓝光谱特征，T1铜位点呈现610 nm附近的特征吸收峰。以ABTS为底物时，最适pH为4.0，但在中性至弱碱性区域仍保留40%以上活性，表现出较宽泛的pH适应性；最适温度为60℃，75℃下半衰期达45分钟，热稳定性优于多数真菌漆酶。底物选择性实验显示，该酶可高效氧化丁香醛连氮、2,6-二甲氧基苯酚以及多种合成染料（如偶氮染料甲基橙），并在介体存在下扩展至多环芳烃氧化，呈现典型的真漆酶底物谱。质谱分析表明，藻类分泌的SLAC分子量较理论值低约2 kDa，对应信号肽切除和铜离子配位状态，不存在因过度糖基化而产生的异质条带，这对于保持酶活一致性至关重要。
值得注意的是，碱性条件并未引发藻细胞大规模破裂：乳酸脱氢酶泄漏检测表明细胞膜完整性保持在90%以上，叶绿素释放微乎其微，说明漆酶活性积累源于主动分泌机制，而非被动释放。转录水平分析进一步揭示，碱切换后，内质网伴侣蛋白（如BiP）和囊泡运输相关基因显著上调，提示碱环境可能通过施加温和胁迫，激发未折叠蛋白应答（UPR）的部分通路，从而“撬动”了蛋白质分泌机器的加工能力。
讨论与展望
该研究为微藻分泌表达体系树立了一个独特范例。嗜酸藻在酸性条件下生长优越，然而分泌途径似乎被“抑制”，当环境变为碱性后，仿佛一个分子开关被拨动，分泌效能成倍提升。这一酸碱调控策略与传统的营养饥饿或高光胁迫诱导截然不同，避免了细胞生长的严重折损，实现了生长和生产的阶段性解耦，尤其适合放大规模培养——在室外光生物反应器中，可先在中性至弱酸性条件下蓄积藻密度，再通过调节pH（例如通入空气或添加少量碱液）启动分泌，操作简便且成本极低。
从酶学应用看，分泌型真漆酶便于直接从上清液中回收，大幅简化下游加工。该SLAC良好的热稳定性和宽 pH 适应性使其在印染废水脱色、木质纤维素预处理与食品加工等领域具备应用潜力。同时微藻体系天然携带的“绿色”标签——利用 CO₂ 和阳光、无致病性——也有望提升产品市场接受度和监管通过率。
当然，推动这一平台走向产业化仍面临诸多挑战。现阶段分泌产量虽已实现突破，但距离商业化所需克升级别的产量尚有距离，需进一步挖掘强启动子和增强分泌途径的靶点，例如共表达分子伴侣或敲除蛋白酶体相关基因。此外，*C. pitschmannii* 的遗传操作工具箱仍显薄弱，基因组编辑工具如CRISPR/Cas尚待建立，这限制了底盘修饰的深度。未来可将碱性条件下的组学分析（蛋白组、磷酸化组）与代谢工程相结合，反向解析酸碱感知与分泌偶联信号网络，从而设计出无需切换pH即能持续高效分泌的超级生产藻株。总之，这项研究不仅交付了一株可用的漆酶藻种，更揭示了一个被长期忽略的“嗜极藻-碱响应”调控窗口，为微藻合成生物学的设计范式注入了新维度的想象力。
参考来源
Stéphanie Gérin, C. Remacle. Efficient secretion of a true laccase by the acidophilic green microalga *Chlamydomonas pitschmannii* switched to alkaline pH. *Journal of Applied Phycology*, 2024. DOI: 10.1007/s10811-024-03299-7.
DOI: 10.1007/s10811-024-03299-7