来源：Int Microbiol | 编译：DNA Lab Space
赤藓糖醇生产菌株为何总被甘露醇“分走”碳流？一项整合多组学与分子对接的研究，锁定了温度调控下的关键酶YlMDH2，为代谢工程改造提供了明确靶点。该成果近期发表于International Microbiology，通讯作者团队来自中国与沙特合作单位。
研究背景
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是工业上生产赤藓糖醇的重要宿主。赤藓糖醇作为一种低热量甜味剂，市场需求持续增长。然而，发酵过程中碳流会分流至甘露醇、D-阿拉伯醇等副产物多元醇，不仅拉低赤藓糖醇的最终得率，还让下游纯化变得复杂，直接推高生产成本。
这种碳流竞争的本质，是赤藓糖醇合成途径与副产物途径对共同辅因子NADPH的争夺。此前研究多聚焦于赤藓糖醇合成途径本身的酶学改造，对竞争性副产物途径的分子调控机制了解有限。特别是甘露醇合成如何受温度影响、由哪个基因主导，一直缺乏系统性解析。
本研究从一株经适应性实验室进化获得的热耐受菌株入手，结合时间序列转录组、qPCR验证、蛋白互作网络与分子对接，系统阐明了YlMDH2（基因座YALI0_D18964g）在温度依赖性甘露醇合成中的核心角色。
研究方法
菌株与培养体系
研究使用了多株解脂耶氏酵母。热响应实验采用参考菌株CGMCC 7326（X969）和热敏感菌株X90.8.4。赤藓糖醇生产实验则使用X90.8.4的高产衍生株HP-Ery。X90.8.4是一株野生型赤藓糖醇生产者，最初分离自植物表面，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC 1675）。
菌株常规维护在YPD琼脂培养基上（酵母提取物10 g L⁻¹、蛋白胨20 g L⁻¹、葡萄糖20 g L⁻¹、琼脂20 g L⁻¹），实验用菌液在YPD肉汤中传代。长期保藏使用无菌20%甘油于−80 °C冻存，并通过菌落形成单位测定定期确认活力，存活率始终高于95%。
热响应实验中，过夜培养物按初始OD₆₀₀约0.1接种至含50 mL YPD培养基的250 mL挡板摇瓶中，分别在30 °C、33 °C、35 °C下以200 rpm振荡培养。细胞生长至对数中期（OD₆₀₀≈1.0）时收获，用于转录组分析。
赤藓糖醇生产实验在5000 mL生物反应器中进行，装液量3000 mL赤藓糖醇诱导培养基（葡萄糖300 g L⁻¹、酵母提取物8 g L⁻¹、胰蛋白胨2 g L⁻¹、(NH₄)₂HPO₄ 2 g L⁻¹，初始pH 5.5）。发酵维持30 °C，通气量1 vvm，搅拌转速600 rpm。在0、24、48、72、96 h时间点取样，用于多组学分析、代谢物谱分析和辅因子定量。
转录组测序与qPCR验证
对高产赤藓糖醇菌株CGMCC7326在促进赤藓糖醇生产的条件下进行RNA测序。同时，对由CGMCC7326经适应性实验室进化获得的热耐受菌株X90.8.4进行平行分析，以考察热适应如何影响赤藓糖醇生产和辅因子利用。
时间序列转录组数据以TPM（每百万转录本）和FPKM（每千碱基转录本每百万映射读数）两种指标呈现。qPCR用于验证YlMDH2在不同温度条件下的表达动态，每个时间点设置三个生物学重复。
蛋白互作网络与分子对接
蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析用于定位YlMDH2在代谢调控模块中的位置。分子对接模拟则用于评估YlMDH2对不同底物的结合亲和力，以揭示其底物偏好性。
研究结果
YALI0_D18964g的表达呈“爆发-消退”模式
转录组分析显示，YALI0_D18964g在赤藓糖醇生产过程中受到强烈的时间依赖性调控。在CGMCC7326菌株中，其转录本水平从0 h的1512.7 ± 51.2 FPKM上升至48 h的2630.7 ± 357.0 TPM（log₂倍数变化= +0.73，q = 1.08 × 10⁻⁸），这一峰值恰好与赤藓糖醇产量高峰吻合。48 h后，表达水平骤降至96 h的482.3 ± 41.0 FPKM（log₂倍数变化= −1.34，q = 4.59 × 10⁻³⁸）。
这种先升后降的“爆发-消退”模式，暗示YALI0_D18964g的活性与赤藓糖醇合成紧密关联，并可能在生产过程中与赤藓糖还原酶（YlER）竞争NADPH。相比之下，热耐受参考菌株则维持了组成型的高表达水平。
温度敏感性表达与甘露醇积累的关联
YlMDH2的转录水平表现出极强的温度敏感性。在33 °C时表达量达到峰值，为8386 ± 441 TPM；当温度升至35 °C时，表达量降至2041 ± 1169 TPM。这种表达变化与甘露醇的积累趋势呈正相关——温度升高促进YlMDH2表达，甘露醇合成增加，赤藓糖醇得率相应下降。
分子对接揭示底物偏好性
分子对接模拟给出了清晰的底物选择性图谱。YlMDH2对D-果糖表现出最优结合亲和力（−12.1 kcal/mol），对D-甘露醇的亲和力次之（−11.6 kcal/mol）。相比之下，该酶对赤藓糖和赤藓糖醇的亲和力显著降低。这一结果从结构层面解释了YlMDH2为何偏向催化甘露醇合成方向——它更“喜欢”六碳糖底物，而非四碳糖。
关键催化残基与辅因子管理模块
研究鉴定出四个关键催化残基：Gln183、Ser173、Ser171和Asn178。这些残基在底物结合和催化过程中扮演重要角色。
PPI网络分析将YlMDH2定位在一个中心的NADPH辅因子管理模块中，该模块与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶相连。这从系统层面揭示了YlMDH2如何参与辅因子分配——它并非孤立工作，而是嵌入在NADPH代谢网络中，与赤藓糖醇合成途径形成直接竞争关系。
qPCR验证与表达动态细节
qPCR验证实验对YlMDH2的表达动态进行了三个生物学重复的确认。结果显示，在时间进程中，各重复之间存在一定变异，但整体趋势与转录组数据一致。平均表达水平的比较进一步确认了YlMDH2、YlER等基因在不同温度条件下的差异化调控模式。
讨论与展望
本研究最直接的贡献，是将YlMDH2确立为温度依赖性甘露醇生物合成的关键调控节点。温度升高时YlMDH2上调，驱动碳流和NADPH向甘露醇方向倾斜，从而与赤藓糖醇合成形成直接竞争。这一机制解释了一个长期困扰发酵工程师的现象——为什么高温条件下赤藓糖醇得率往往不升反降。
从应用角度看，YlMDH2是一个极具吸引力的改造靶点。敲除或下调该基因，理论上可减少甘露醇副产物的形成，将更多碳流和辅因子导向赤藓糖醇合成途径。分子对接揭示的底物偏好性也为酶工程改造提供了结构基础——若能将YlMDH2对六碳糖的亲和力进一步削弱，或增强其对四碳糖的催化活性，有望实现更精细的代谢流调控。
不过，研究也存在需要进一步探索的空间。PPI网络分析提示YlMDH2与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶存在功能关联，但具体的代谢调控机制尚待实验验证。此外，热耐受菌株X90.8.4中YlMDH2维持高表达的分子机制——是启动子区域的突变还是转录因子水平的改变——同样值得深入研究。
参考来源
Iqbal MS, Xu S, Zhang Y, Ji L, Alzahrani KJ. Elucidating the role of YlMDH2 in temperature-dependent mannitol biosynthesis in Yarrowia lipolytica via integrative multi-omics and structural analysis. Int Microbiol. PMID: 41954857. DOI: 10.1007/s10123-026-00820-5.
PMID: 41954857