来源：Int J Mol Sci | 编译：DNA Lab Space
导读
南极极端环境孕育了独特的微生物多样性与新型天然产物资源。本研究从南极土壤中分离的红球菌GB-02菌株入手，通过杂交基因组组装获得6.58 Mb高质量基因组，确认其属于红球菌属内一个此前未描述的新基因组谱系。结合基因组挖掘与计算预测，研究鉴定出8个推定抗菌肽，其中一条命名为Peptide 5764的候选肽在体外实验中展现出对革兰氏阳性及阴性病原菌的抗菌活性，并能浓度依赖性地抑制生物膜形成，为极地微生物来源的抗菌肽开发提供了概念验证。
研究背景
南极洲的极端环境——持续低温、强烈紫外辐射、营养匮乏和反复冻融循环——对微生物进化施加了强大的选择压力，推动其发展出特殊的代谢途径和生存策略。这些压力加剧了对稀缺资源的竞争，促使微生物演化出拮抗活性和产生抗菌次级代谢物的防御机制。放线菌门因能合成多种具有显著药理活性的生物活性化合物而备受关注。红球菌属以其代谢多样性和极端环境适应能力著称，但其抗菌潜力——尤其是代表未描述基因组谱系的菌株——在很大程度上尚未被探索。本研究以分离自南极土壤的红球菌GB-02菌株为对象，系统考察其基因组是否编码对临床相关病原菌具有可验证活性的抗菌肽。
研究方法
4.1 南极细菌菌株的培养与DNA提取
本研究使用一株此前从土壤中分离的南极细菌菌株（编号GB-02）。土壤样品采集自格林威治岛（普拉特站），由智利南极研究所（INACH）组织的第53次智利南极考察（ECA）期间完成。细菌分离步骤为：将100 mg土壤悬浮于1 mL无菌蒸馏水（终体积）中，涡旋剧烈搅拌30 s。随后取10 μL悬浮液接种于990 μL Luria–Bertani（LB）肉汤（胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L）中，15 °C孵育24 h。之后取等分试样涂布于LB琼脂平板（细菌学琼脂15.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、氯化钠10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L），同温度下培养7天。通过将单菌落连续转接至LB琼脂获得纯培养物，随后以20%甘油于−80 °C冷冻保存。
用于DNA提取的培养物通过将分离菌株接种于LB琼脂、15 °C培养7天获得。基因组DNA提取使用ZymoBIOMICS™ DNA提取试剂盒（D4300，ZYMO RESEARCH，美国加利福尼亚州尔湾塔斯廷），严格按制造商方案操作。DNA浓度以Qubit dsDNA HS检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）定量，确保最低浓度≥50 ng/µL。DNA完整性通过0.9%（w/v）琼脂糖凝胶电泳（1× TAE缓冲液）评估。Rhodococcus sp. GB-02在BSL-2条件下按标准实验室程序操作。使用综合抗生素耐药数据库（CARD）进行基因组分析，未发现已知毒力因子。
4.2 文库构建与全基因组测序
基因组测序采用Illumina与Oxford Nanopore Technologies（ONT）平台相结合的杂交策略。Illumina文库使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒（Illumina，美国加利福尼亚州圣迭戈）制备配对末端150 bp读长，并在Illumina NovaSeq系统上测序。ONT测序在智利拉弗龙特拉大学科学生物资源核心设施（BIOREN）进行。ONT文库使用快速测序试剂盒SQK-RBK004按制造商建议制备，并在MinION Mk1C平台上使用R9.6流动池测序。所得读长的碱基识别使用Guppy v5.0.12以快速模式完成（MinKNOW软件v.4.3.7）。
4.3 杂交基因组组装
组装同时使用Illumina和ONT测序数据集。Illumina读长质量先用FastQC v0.11.9评估，随后使用Fastp v0.20.0以默认参数进行接头修剪和质量过滤。ONT读长用Nanoplot v1.40.0评估，使用Porechop v0.2.4去除接头，并以Nanofilt v2.8.0进行进一步质量过滤（Q > 10）。对于从头杂交组装，使用Unicycler v0.4.8组装高质量短读长和长读长，所得组装结果用Bowtie2 v2.4.2和Pilon v1.24进行抛光。最后，使用CheckM v1.1.3评估精制杂交基因组的质量和潜在污染。本研究产生的基因组组装已提交至美国国家生物技术信息中心（NCBI），BioProject登录号为PRJNA1294779。
4.4 系统发育基因组学分析
为确定GB-02的系统发育位置和亲缘关系，从LPSN数据库（https://lpsn.dsmz.de/genus/rhodococcus，访问日期：2026年2月15日）中检索红球菌属各物种模式菌株的所有可用基因组组装，纳入使用Type Strain Genome Server（TYGS）（https://tygs.dsmz.de，访问日期：2026年2月15日）进行的系统发育基因组学分析。该工具基于MASH算法的整合方法进行基因组系统发育，结合16S rRNA系统发育和数字DDH估算。密切相关的基因组先用MASH算法初步鉴定。随后提取16S rRNA基因序列并使用BLAST v2.16.0（NCBI）进行比较以确认系统发育亲缘关系。所有基因组间的两两比较使用基因组BLAST距离系统发育（GBDP）方法进行，精确基因组间距离在算法“trimming”和距离公式d5下推断。随后通过FASTME 2.1.6.1获得平衡最小进化树，包括SPR后处理，分支支持基于100次伪自举重复。物种聚类采用70% dDDH半径，亚种聚类采用79% dDDH阈值。平均核苷酸一致性（ANI）使用JSpeciesWS在线服务（https://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/，访问日期：2026年2月17日）计算。最后使用Interactive Tree Of Life（iTOL）v5（https://itol.embl.de/，访问日期：2026年2月17日）构建系统发育基因组树。为进一步评估GB-02菌株超出模式材料范围的基因组相关性，进行了基于ANI的比较分析，纳入NCBI中所有公开可用的红球菌基因组组装。基因组按组装水平（重叠群、支架、染色体和完整基因组）和组装质量进行过滤，仅保留≤100个重叠群的组装用于下游分析。此外，使用一组南极红球菌菌株对GB-02基因组进行了ANI比较，以将GB-02置于环境相关菌株的背景下。
4.5 基因组注释与代谢重建
基因组注释使用Bakta网络服务器v1.11.0完成，并使用PROKSEE服务器v1.1.2构建GB-02的环形图谱，提供其基因组特征的视觉概览。基于COG（直系同源簇）分类的功能类别使用eggNOG-mapper v.2的在线版本获得。此外，使用基于整合IA的工具Ibis v3.1通过“完整基因组注释”方案重建代谢途径。数据还与京都基因与基因组百科全书（KEGG）的途径信息整合，并使用iPath3.0工具将GB-02代谢途径与最近物种Rhodococcus erythropolis IEGM 1415（GCF_027270535.1）和Rhodococcus sp. IEGM 1318（GCF_033142465.1）进行比较。
4.6 生物合成基因簇与抗菌肽预测
使用antiSMASH v7.1.0基于次级代谢分析预测生物合成相关基因簇，采用宽松检测参数，包括以下预测功能：“KnownClusterBlast”、“MIBiG cluster comparison”、“Cluster Pfam analysis”、“TFBS Analysis”、“ClusterBlast”、“ActiveSiteFinder”、“Pfam-based GO term annotation”、“SubClusterBlast”、“RREFinder”和“TIGRFam analysis”。此外，使用BAGEL 4鉴定编码细菌素和核糖体合成及翻译后修饰肽（RiPPs）的基因。还使用红球菌模式菌株、南极红球菌以及数据库中鉴定为最接近的两个非模式红球菌基因组（表S4）的基因组集合进行了BGC比较。
此外，对GB-02基因组中先前分析未覆盖的小肽进行了鉴定。为进一步探索Rhodococcus sp. GB-02的生物合成潜力，分析了小肽（≤100个氨基酸）以识别先前BGC分析中未检测到的潜在抗菌肽（AMPs）。预测使用互补工具AI4AMP（http://symbiosis.iis.sinica.edu.tw/PC_6/，访问日期：2026年1月5日）、CAMP（原文此处截断，后续工具信息原文未详述）。
研究结果
2.1 Rhodococcus sp. GB-02的基因组特征
通过杂交组装获得的GB-02菌株草稿基因组由15个重叠群组成，N50为1,524,266 bp，总长6,580,818 bp，平均测序深度98.81×，GC含量62.3%。基因组中共预测到6092个蛋白质编码基因和67个RNA基因（包括52个转移RNA（tRNA）、12个核糖体RNA（rRNA）和3个非编码RNA（ncRNA））。基因组序列的示意性可视化如图1a所示。
图1b显示，菌株GB-02与两株模式菌株——Rhodococcus erythropolis JCM 3201和Rhodococcus antarcticus 75——亲缘关系最近，确认其归属于红球菌属（诺卡氏菌科，放线菌门）。然而，GB-02与这些模式菌株之间的数字DNA–DNA杂交（dDDH）和平均核苷酸一致性（ANI）值均低于公认的物种水平阈值（dDDH为70%，ANI为95–96%）（表1），表明GB-02不属于任何当前有效描述的物种。与公开可用的红球菌组装进行的全基因组ANI比较进一步揭示，只有两个基因组在与GB-02比较时超过95–96%的物种划分阈值，即Rhodococcus erythropolis IEGM 1415（GCF_027270535.1）和Rhodococcus sp. IEGM 1318（GCF_033142465.1），ANI值分别为98.1%和98.7%（补充表S1）。这些基因组不对应于有效发表物种的模式菌株。综合来看，这些结果表明，尽管GB-02与这些分离株属于同一基因组物种，但它不能被归入任何当前有效描述的物种，因此代表了该属内一个尚未正式描述的独特基因组谱系。
基于直系同源簇（COG）的功能分析使用eggNOG mapper v2进行。对于菌株GB-02，6261个基因中的5917个（94.51%）被归类到21个不同的COG类别中（图2）。功能未知类别（S：1144）数量最多，暗示该分离株尚未开发的潜力。注释基因数量最多的是参与代谢的基因（2858个基因，48.30%），其次是信息存储与处理（1071个基因，18.10%）和细胞过程与信号传导（844个基因，14.26%）。其中，654个编码序列（CDS）与转录相关，凸显了细胞在调控基因表达和蛋白质合成中的作用。此外，574个CDS与氨基酸转运和代谢相关，表明其具有合成、降解和输入氨基酸的强大代谢能力。
KEGG途径分析（图3）重建了GB-02基因组中编码的代谢途径和功能模块，提供了超越整体功能分类的代谢架构见解。共有1999个基因（占所有CDS的31.93%）被分配到41条KEGG途径，揭示了一个高度互联的代谢网络。KEGG分析并非反映整体功能丰度，而是突出显示了完整和替代代谢路线的存在，包括中心碳代谢、能量产生和特化生物合成过程。
具体而言，根据KEGG途径分类，GB-02拥有与碳水化合物、氨基酸和核苷酸代谢、膜转运以及特化代谢功能（包括萜类和多酮化合物代谢以及次级代谢物生物合成）相关的途径。环境信息处理类别中膜转运途径的富集（101个基因，5.05%）表明其具有增强的底物摄取和胁迫适应能力。
除途径丰度外，功能模块分析（补充表S2）揭示了一个代谢多能的中央系统，整合了经典糖酵解、磷酸戊糖途径（模块M00001、M00002、M00003、M00004、M00006和M00007）和Entner–Doudoroff途径（M00008）、完整的三羧酸循环（M00009–M00011）以及乙醛酸支路（M00012），表明其在碳同化和能量产生方面具有代谢灵活性。基因组还编码了必需氨基酸、核苷酸、维生素和辅因子生物合成的完整途径，包括谷胱甘肽（M00118）、泛酸和辅酶A（M00119–M00120）、生物素（M00123）、核黄素（M00125）、四氢叶酸（M00126）、硫胺素（M00127）、吡哆醛磷酸（M00916）和甲萘醌（M00116），支持广泛的生物合成自主性。
参与呼吸能量代谢的模块也得到充分体现，包括NADH脱氢酶（M00144）、琥珀酸脱氢酶（M00149）、细胞色素氧化酶（M00151、M00153和M00155）和F型ATP合酶（M00157），表明存在完整且高效的好氧电子传递链。其他适应功能包括多药外排系统（M00649、M00700、M00702、M00705、M00714和M00718）、通过PgtE系统对阳离子抗菌肽的耐药性（M00744）、渗透保护剂甜菜碱（M00555）、海藻糖（M00565）的生物合成以及四氢嘧啶降解（M00919），以及铁载体生物合成（M00875），所有这些都与增强的环境胁迫和营养缺乏耐受性一致。
此外，GB-02编码了多个特化代谢模块，包括β-胡萝卜素生物合成（M00097）、尼古丁降解（M00810）、C-1027 β-氨基酸部分生物合成（M00827）以及甲萘醌生物合成的futalosine途径（M00930和M00931）。综合来看，这些模块表明其具有更强的呼吸灵活性、氧化应激保护、膜适应、铁获取和特化代谢能力，支持GB-02的生态适应性，并提供了与其抗菌表型一致的功能基因组框架。
与Rhodococcus erythropolis IEGM 1415（GCF_027270535.1）和Rhodococcus sp. IEGM 1318（GCF_033142465.1）的比较分析鉴定出26个GB-02独有的KEGG模块（补充表S3），表明其具有更广泛的代谢和适应能力。这些模块包括与膜重塑和脂质代谢相关的途径（M00059、M00067、M00068和M00090）、通过β-胡萝卜素生物合成（M00097）和谷胱甘肽生物合成（M00118）实现的抗氧化保护、一碳代谢（M00140），这些都可能有助于环境胁迫下的细胞稳态。GB-02还独有编码细胞色素bc1呼吸复合体（M00152）以及futalosine和修饰futalosine途径用于甲萘醌生物合成（M00930和M00931），表明呼吸电子传递具有额外灵活性。多个与环境适应相关的模块也是GB-02独有的，包括多药外排系统（M00649和M00718）、对阳离子抗菌肽的耐药性（M00744）、通过staphyloferrin B途径的铁载体生物合成（M00875）、尼古丁降解（M00810）、绿脓菌素相关次级代谢物生物合成（M00835）以及C-1027 β-氨基酸部分生物合成（M00827），突显了其在营养受限环境中竞争和生存的增强能力。总体而言，GB-02独有的代谢谱支持一个富含呼吸多功能性、胁迫耐受性、膜适应、铁获取和特化代谢的基因组，这些特征与其生态适应一致，并可能有助于其抗菌潜力。这些差异共同描绘了GB-02与其最近系统发育基因组亲缘种不同的生物合成和适应库，并为本研究中探索的抗菌潜力提供了基因组基础。
2.2 次级代谢物分析
2.2.1 生物合成基因簇
基因组挖掘结果（原文此处截断，后续内容未在节选中完整呈现）。
讨论与解读
红球菌属为革兰氏阳性、好氧、不产孢细菌，具有高G+C含量（61–71%）和大基因组（5–10 Mb），常见于土壤、水和海洋沉积物中。菌株GB-02分离自南极土壤，基因组大小6,580,818 bp，G+C含量62.3%，与红球菌属成员已报道的基因组特征一致。重要的是，系统发育基因组学结果确认菌株GB-02代表了该属内一个此前未描述的基因组谱系。为探究这一独特谱系编码的抗菌潜力，本研究整合了基因组挖掘、生物合成基因簇表征、抗菌肽预测以及优先候选肽的实验验证。
GB-02的基因组特征表明其具有高度的代谢多功能性，这是适应极端和竞争环境的红球菌物种的标志。归属于“功能未知”COG类别的基因占比可观（19.33%），与先前在南极土壤细菌中的观察一致，提示存在可能与次级代谢物生物合成相关的未探索代谢功能。GB-02基因组的功能注释与一个生物合成特化菌株而非代谢泛化菌株的特征相符。在6092个预测蛋白质编码基因中，654个CDS（10.74%）与转录相关（原文此处截断，后续讨论内容未完整呈现）。
编译者解读
本研究展示了“基因组引导”策略在极地微生物天然产物发现中的实际价值——先从全基因组序列出发锁定未描述谱系，再通过计算预测筛选候选抗菌肽，最后用实验验证活性。这种方法相比传统活性筛选的优势在于能发现低丰度或条件性表达的肽类分子。Peptide 5764虽在微摩尔浓度下对多种病原菌有效，但其显著的溶血活性提示膜选择性不足——这是阳离子抗菌肽开发的经典瓶颈。后续工作若能在肽序列优化（如D-氨基酸替换、环化）和递送策略上着力，或可改善其治疗指数。此外，GB-02基因组中大量“功能未知”基因和多个低相似度BGC的存在，意味着该菌株可能还隐藏着更多值得挖掘的新型生物合成潜力。
参考来源
González D, Santos A, Sans-Serramitjana E, Guzmán F, Gallardo-Benavente C. Genome-Guided Discovery of an Antimicrobial Peptide Scaffold from an Undescribed Antarctic Rhodococcus Lineage: A Proof-of-Concept Study. Int J Mol Sci. PMCID: PMC13467173.
PMCID: PMC13467173