来源：World J Microbiol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
每年大气CO₂以2.11%的速率持续攀升，约53年后或达1200 ppm毒性阈值。本研究以氨预处理稻草为底物，引入CaO/Ag纳米催化剂，对比酿酒酵母与土曲霉单菌及共菌体系在同步糖化发酵中的乙醇产量差异。结果显示氨预处理使纤维素含量从38.88%升至55.87%，纳米催化剂对酿酒酵母产糖有促进作用，但对土曲霉体系净糖产量产生抑制，乙醇最高产量由酿酒酵母单独发酵获得。
研究背景
化石燃料燃烧使碳排放近年增长近57.5%，不可再生资源枯竭与全球人口膨胀共同加剧了能源需求压力。生物燃料将可再生能源与减贫、农业发展及气候减缓相联结，生物乙醇作为可替代燃料，通过微生物发酵糖类或淀粉质生物质生产。水稻秸秆富含纤维素与半纤维素，是极具潜力的木质纤维素原料。然而，木质素的致密结构阻碍了酶解效率，碱性预处理可破坏木质纤维素架构、暴露纤维素纤维。近年来，纳米催化剂因其高比表面积与催化活性被引入生物转化过程，但金属纳米颗粒对发酵微生物的毒性效应尚存争议。本研究利用廉价鸡蛋壳与葫芦巴叶提取物合成的CaO/Ag纳米催化剂，系统评估其在氨预处理稻草同步糖化发酵中对两种真菌的单菌及共培养体系的影响。
研究方法
化学试剂、培养基、微生物与纳米催化剂
本研究所用化学试剂包括纯水、氢氧化铵溶液、酵母-葡萄糖-琼脂培养基（YDA，BIOLAB Inc.，匈牙利）和沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，BIOLAB Inc.，匈牙利）。土曲霉（Aspergillus terreus）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）用于发酵实验。曲霉菌株自稻草碎屑中分离，商业新鲜酵母购自面包坊。将曲霉菌株引入发酵过程可望作为低成本纤维素酶生产者。本研究所用CaO/Ag纳米催化剂为环境友好型非均相催化剂，以鸡蛋壳和葫芦巴叶提取物为原料低成本合成（El-sherif et al. 2023），该催化剂此前已成功将废弃食用油转化为具有燃料品质的生物柴油。整体实验设计流程见图形摘要：自稻草收集与氢氧化铵碱性预处理开始，经SEM/EDX结构表征观察形态与元素变化，随后进行MIC测定以确定纳米催化剂对两种受试真菌的抑制阈值，继而开展同步糖化发酵（SSF），分别以酿酒酵母和土曲霉单独或联合接种，并设置添加与不添加纳米催化剂的对照，通过DNS法测定还原糖、分析发酵产物，最终产出生物乙醇。
曲霉与酵母的分离及接种物制备
采用系列稀释法自埃及水稻秸秆-土壤碎屑中分离曲霉菌株，接种于添加350 mg/L孟加拉红和100 mg/L氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基上，平板培养7天，温度25 °C（Reynolds 2005）。商业新鲜面包酵母（即酿酒酵母）接种于沙氏培养基上培养，随后纯化获得用于酒精发酵的纯培养物。各微生物分离物随后接种于YDA培养基。真菌纯化斜面于25 °C培养7天，4 °C保存作为储备培养物备用。
CaO/Ag纳米催化剂对受试真菌的MIC测定
将不同浓度的CaO/Ag样品（1、1.5、2、2.5、…、10 µg/ml）施加于已接种受试真菌（酿酒酵母和土曲霉）的SDA琼脂平板中央孔中。肉汤培养基浊度试验确证琼脂扩散法数据。最低抑菌浓度（MIC）值确定为37 °C培养7天后抑制真菌生长的最低纳米催化剂浓度。MIC测定于37 °C进行，遵循标准抗真菌药敏试验规程（CLSI M27-A3），该规程规定35–37 °C孵育以确保受试微生物可靠生长（Pfaller and Diekema 2010）。微生物生长通过测量抑菌圈直径计算（Velmurugan et al. 2012）。后续处理中施加的纳米颗粒浓度低于两种受试真菌的最低MIC值。
稻草制备与特性分析
农场采集的稻草（RS）在研磨前用剪刀剪成小碎片，过60目筛后于120 °C真空干燥1 h（Chen et al. 2012）。120 °C高温用于干燥并灭菌稻草，近期研究亦有使用相近温度（Karuna et al. 2014; Abdelhamed et al. 2024）。获得均匀粉末后，通过成分分析研究稻草特性。按照Thiex et al.（2012）提供的规程，灰分含量于550 °C马弗炉中测定6 h。水分含量采用烘箱干燥法测定（Nirmaan et al. 2020）。此外，稻草表面微观结构与元素分布采用扫描电子显微镜（SEM）耦合能量色散X射线探测器（EDX）研究（Abdel-Hamied et al. 2022），傅里叶变换红外光谱（FTIR，电磁辐射波长约51–510 μm）和X射线衍射（XRD，利用各粒子2θ峰高相互关系）作为结构分析工具。SEM图像使用Zeiss LEO Supra 55VP场发射扫描电镜和Zeiss 1530 SEM拍摄。稻草结晶度指数采用峰强度法按以下方程计算（Li et al. 2012; Tsegaye et al. 2019）：
CrI = (I002 − IAm) / I002 × 100
其中I002表示结晶组分相关主峰的强度，IAm反映约2θ = 11.5°处与非晶部分相关的峰强度，相当于背景噪声（Tarchoun et al. 2019）。
稻草成分表征采用木质纤维素生物质研究中通用的标准分析规程。纤维素、半纤维素和木质素含量按照两步酸水解法测定，该方法可定量分离结构性碳水化合物与酸不溶性木质素。灰分含量通过高温燃烧后重量法测定，水分含量通过烘箱干燥至恒重测定。这些标准化方法在文献中广泛报道，可在生物乙醇和生物精炼研究中可靠比较生物质组成数据（Sun and Cheng 2002; Kumar et al. 2009; Sluiter et al. 2010）。
稻草的氢氧化铵预处理
稻草经化学预处理以提升纤维素和半纤维素含量、降低木质素含量，从而增加乙醇生产所需还原糖的产量。本研究使用10%氢氧化铵溶液处理稻草（Xu et al. 2024）。室温下，稻草浸泡于稀释的氢氧化铵溶液中两天。干固体稻草与铵溶液的比例为1:15 w/v。随后，稻草用自来水和蒸馏水多次洗涤至中性。洗涤后的稻草于60 °C烘箱干燥。对干燥稻草重复前述表征以考察铵处理效果。预处理后的稻草固体部分随后用作微生物生物测定的碳底物，用于还原糖和生物乙醇生产。
氨预处理稻草的糖化与发酵
经铵预处理的稻草固体部分用作还原糖和乙醇生产生物测定的底物。发酵实验设置三种接种方式：酿酒酵母单独接种、土曲霉单独接种、酿酒酵母与土曲霉联合接种，每种接种方式分别设置添加与不添加CaO/Ag纳米催化剂的两个处理组。纳米催化剂的施加浓度低于两种受试真菌的最低MIC值。同步糖化发酵（SSF）过程中，还原糖浓度通过DNS法测定，乙醇浓度通过高效液相色谱（HPLC）测定。每个处理组设置三个独立重复（n = 3），数据以平均值±标准差（SD）表示。
研究结果
本研究旨在评估CaO/Ag纳米催化剂对氨预处理稻草转化为还原糖和生物乙醇的促进或抑制作用。评估预处理后稻草的变化是糖化和发酵前第一个也是最关键的步骤。
CaO/Ag纳米催化剂的MIC
CaO/Ag纳米催化剂对受试真菌的MIC值（表1）分别为：酿酒酵母3.5 ± 0.22 µg/ml，土曲霉5.5 ± 0.33 µg/ml。
表1 CaO/Ag纳米催化剂对受试真菌的最低抑菌浓度（MIC）。数据以平均值±标准差表示（n = 3）
| 受试真菌 | MIC（µg/ml） |
|---------|-------------|
| 酿酒酵母 | 3.5 ± 0.22 |
| 土曲霉 | 5.5 ± 0.33 |
银纳米颗粒（AgNPs）已表现出对细菌、真菌和病毒的活性（Arshad et al. 2024）。Mallmann et al.（2015）的研究中，绿色合成的AgNPs对酵母（包括白色念珠菌和热带念珠菌）表现出高活性，其抗菌活性与抗真菌药两性霉素B相当。尽管SSF过程中施加的CaO/Ag纳米催化剂浓度低于酿酒酵母（3.5 µg/mL）和土曲霉（5.5 µg/mL）的MIC值，但生物乙醇产量和糖利用率仍出现下降。这表明存在亚致死抑制效应而非完全的微生物生长抑制。银纳米颗粒即使在MIC阈值以下的浓度也可产生活性氧（ROS）、破坏膜完整性、干扰酶功能和DNA复制（Pal et al. 2007; Kim and Ryu 2013; Rai et al. 2009）。Lee et al.（2019）证实AgNPs可诱导真菌细胞中ROS介导的代谢损伤，导致葡萄糖摄取减少和细胞周期进程延迟。类似地，AgNPs已被报道可引起脂质过氧化、巯基结合和DNA损伤，从而损害必需代谢过程（Morones et al. 2005; Sharma et al. 2009）。这些机制可能解释了对发酵的拮抗效应，尽管微生物活力得以维持。因此，仅凭MIC测定无法反映亚MIC水平下发生的代谢紊乱，在优化纳米催化剂浓度时必须予以考虑。
为将本研究发现置于纳米催化剂在发酵中应用的现有研究背景下，我们与类似研究进行了比较。银纳米颗粒在微生物发酵中已被报道可降低乙醇产量并增加有机酸副产物，主要由于ROS的产生即使在亚致死浓度下也会损害细胞代谢（Pal et al. 2007; Rai et al. 2009）。Lee and Jun（2019）证实AgNPs在真菌和酵母细胞中诱导ROS介导的代谢应激，导致糖摄取和发酵效率降低。与以往研究不同，本工作明确研究了在CaO/Ag纳米催化剂存在下土曲霉与酿酒酵母在同步糖化发酵（SSF）中的共培养，独特地识别了亚MIC代谢抑制和副产物积累是限制乙醇产量的关键因素。
碱性预处理后稻草的变化
稻草成分
稻草制备对于平衡干燥条件以增强化学处理效率同时防止结构组分过度降解至关重要（Remli et al. 2014）。所选干燥条件（120 °C真空干燥1 h）可有效去除水分而不显著改变稻草的化学结构——稻草由纤维素、半纤维素和木质素组成（Aski et al. 2019; Nakyp et al. 2024）。因此，该方法确保原料保留生物燃料生产所需的关键组分，同时防止过度热降解。
未处理原料与预处理稻草的化学成分结果列于表2。处理前稻草成分为：纤维素38.88%，半纤维素24.34%，酸洗涤木质素3.28%，灰分16.46%，水分5.78%。生长期间的发育水平和环境变量影响稻草的组分含量（Van Hung et al. 2020）。由于大多数稻草由可转化为单体糖的全纤维素组成，因此被认为是发酵过程中合适的碳源（Boonsombuti et al. 2020）。
表2 碱性预处理对稻草成分的影响（%）
| 成分 | 未处理（%） | 预处理（%） |
|------|------------|------------|
| 纤维素 | 38.33 | 55.87 |
| 半纤维素 | 24.34 | 21.72 |
| 木质素 | 3.28 | 4.26 |
| 灰分 | 16.46 | 7.33 |
| 水分 | 5.78 | 1.93 |
氢氧化铵预处理后，稻草中相对纤维素含量从38.88%增至55.87%，半纤维素含量从24.2%降至21.72%。灰分含量以限制性方式影响生物燃料转化（Kumari and Singh 2022），但可通过处理改善。含硅灰分从16.46%降至7.33%。糖化和发酵微生物的可及性以及纤维素纤维含量的增加均受灰分降低的影响（Takano and Hoshino 2018）。处理后木质素含量无显著变化。纤维素组分的提升是积极结果——该增加并不表示纤维素的净增益，而是半纤维素部分去除导致的浓缩效应，与碱性预处理的结果一致。文献中广泛报道了类似模式，成分变化反映了生物质结构的改变（Sun and Cheng 2002）。Kumar et al.（2020）报道了纤维素含量增加的相似结果（42.9%至46.3%）。作者发现，与其他碱相比，10%浓度氨预处理稻草在酶解后产生高量还原糖。鉴于有效利用这些生物质多糖生产乙醇的重要性，本研究建议10%氨预处理可在半纤维素损失最小的情况下获得可接受的结果。
稻草表面形貌（SEM-EDX）
图1A和B显示，未处理稻草的表面结构均匀致密，含有纤维状条纹。该发现表明纤维被木质素覆盖（Phitsuwan et al. 2017）。研究结果与Tsegaye et al.（2019）报道的结论一致。观察到的微小裂缝可能由切割和研磨操作形成——生物质尺寸减小导致结构变化和断裂（Kumar et al. 2020）。
化学处理是改变植物生物质组成和结构最关键的步骤之一，也可有效去除木质素和半纤维素（Samsalee et al. 2024）。图1C和D展示了氨预处理稻草的表面形貌。经氨处理后，稻草表面呈现出明显的结构解体，纤维束松散且表面粗糙度增加，表明木质素-半纤维素-纤维素复合体的部分拆解。
图3展示了未处理稻草与氨预处理稻草（PRS）的X射线衍射图谱。结晶度指数（CrI）计算基于I002峰强度与非晶峰强度之差与I002峰强度的比值。氨预处理后稻草的结晶度指数发生变化，反映了无定形组分（半纤维素和部分木质素）的去除以及结晶纤维素相对比例的提升。
图4展示了未处理稻草（RS）与氨预处理稻草（PRS）的FTIR光谱。光谱中特征吸收峰的位移与强度变化证实了预处理对稻草化学键合结构的修饰作用，包括纤维素氢键网络的改变与半纤维素相关吸收峰的减弱。
不同条件下的细胞生物量与还原糖产量
图5比较了不同条件下的细胞生物量（每100 mL培养基的鲜重）。三个实验组分别对应接种酿酒酵母、土曲霉以及酿酒酵母+土曲霉联合接种的培养体系。每组两根柱分别代表对照培养（不含CaO/Ag纳米催化剂，蓝色柱）和添加纳米催化剂的培养（橙色柱）。每根柱代表每个样品三次重复（n = 3）的平均值±标准差（SD）。
图6展示了使用不同真菌接种物从稻草获得的还原糖浓度（mg/L）。三个实验组对应酿酒酵母、土曲霉以及酿酒酵母+土曲霉联合接种的批次。每组两根柱分别代表对照培养（不含CaO/Ag纳米催化剂，蓝色柱）和添加纳米催化剂的培养（橙色柱）。数据以三次独立重复（n = 3）的平均值±SD表示。
结果显示，纳米催化剂促进了酿酒酵母批次中可发酵还原糖的释放。然而，与土曲霉组合时，纳米催化剂对所得还原糖的净产物表现出显著抑制效应——糖浓度从5.2 mg/L降至3.8 mg/L。最大乙醇产量由酿酒酵母单独发酵获得，但银纳米颗粒对酵母发酵表现出轻微不利影响。两种微生物同时糖化和发酵降低了乙醇产量，但纳米催化剂的加入显著改善了产量。
微生物分子鉴定
ITS测序和BLAST比对验证了微生物身份：土曲霉（At PP590607）相似性98.1%，酿酒酵母（Sc OR668931）相似性99.6%。图7展示了（A）酿酒酵母和（B）土曲霉的系统发育树。
讨论与解读
本研究系统比较了经济环保的纳米辅助糖化和发酵方法，确定CaO/Ag纳米催化剂对稻草还原糖和生物乙醇产量的影响。10%氨预处理的有效性得到验证：纤维素相对含量显著增加、碳元素含量提升、预处理稻草表面形貌改变明显、结晶度指数改善。CaO/Ag纳米催化剂对分子鉴定为土曲霉（At PP590607）的菌株表现出刺激生长作用，而对酿酒酵母（Sc OR668931）有轻微抑制作用。两种真菌物种对纳米催化剂的响应不同。鉴于添加纳米催化剂的酿酒酵母批次与对照相比糖还原显著改善，本研究提示CaO/Ag纳米颗粒可作为额外化学处理或水解步骤的潜在用途。
编译者解读
本研究揭示了纳米催化剂在木质纤维素生物转化中的"双刃剑"效应——CaO/Ag在促进酿酒酵母产糖的同时抑制土曲霉的净糖产量，这一发现提示合成生物学应用中纳米材料与微生物互作的复杂性。方法上，利用废弃鸡蛋壳和植物提取物合成纳米催化剂契合绿色合成理念，但亚MIC浓度下仍存在的代谢抑制提示实际应用时需精细调控催化剂剂量。未来若能将纳米催化剂定向修饰以选择性增强纤维素酶活性而降低对发酵菌株的毒性，或通过工程菌株增强ROS耐受性，将可能释放该技术路线的更大潜力。
参考来源
Hamad AM, El-Sherif AA, Ahmed AM, Mohamed HAAE, Shams-Eldin E. Ethanol production from rice straw: Comparative study of single and combined use of CaO/Ag nanocatalyst with Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus terreus. World J Microbiol Biotechnol. PMID: 41806258.
PMID: 41806258