来源：Microb Cell Fact | 编译：DNA Lab Space
导读
绿色荧光蛋白（GFP）是生物医学诊断和生物技术应用中广泛使用的大分子工具，但传统水母来源的GFP存在亮度不足和低氧环境下适用性受限等缺陷。本研究从埃及红海海域的鱿鱼及海水样品中分离出11株荧光细菌，经筛选获得一株高效产GFP的Pseudomonas gessardii E2菌株。通过单因子优化策略，荧光强度提升1.51倍；结合双水相系统与快速蛋白液相色谱纯化，最终获得纯度达96.3%的GFP。该研究为开发海洋微生物来源的新型GFP提供了可行路径。
研究背景
绿色荧光蛋白因其低毒性、内在荧光特性以及无需外源底物或辅因子即可发光的特点，在生物医学诊断和多种生物技术应用中具有重要价值。然而，传统来源于维多利亚水母（Aequorea victoria）的GFP存在固有局限——亮度相对较低，且在低氧条件下的适用性受到限制。因此，寻找替代性的、尚未充分开发的微生物GFP来源，尤其是海洋环境中的微生物来源，已成为合成生物学领域日益关注的方向。
研究方法
样品采集与细菌分离
2022年12月清晨，从埃及亚历山大市迈阿密海滩的当地渔民处获得三只新鲜捕获的海洋鱿鱼。样品置于半浸没式冰盒中，以18°C海水保存，随后立即运回研究实验室。鱿鱼标本用蒸馏水轻轻冲洗，去除附着的沙粒或碎屑，并保持低温以抑制杂菌生长、防止腐败。海水样品采自埃及红海萨法加市阿图比亚岛（26°49'49.6" N, 33°58'42.87" E），采样深度14 m，距海岸2.4 km。水温、pH和电导率等水质参数通过便携式多参数水质仪（hydrolab）测定。水样收集于无菌250 ml瓶中，4°C保存至实验室处理[22]。
采用三种分离培养基：海水完全琼脂培养基（SWC）[23]、发光培养基（LM）[24]和Boss培养基[25]。用棉签擦拭鱿鱼的多个解剖部位——包括眼、鳃、皮肤、肠道和触手——划线接种于分离培养基表面，20°C孵育72 h[26, 27]。无菌解剖肠道区域以提取墨囊。取1 ml墨汁无菌转移至含9 ml发光肉汤的Falcon管中制备10⁻¹稀释液，随后进行系列稀释至10⁻⁵。取各稀释度及海水样品0.1 ml涂布于三种不同培养基上，在相同条件下孵育[28]。
孵育结束后，在暗室中使用MOPEL ENF-260 C型UV灯（365 nm，MOPEL instruments，纽约，美国）检查平板上荧光菌落。小心挑取荧光菌落，重新划线接种至新鲜分离培养基以获得纯培养物。
荧光细菌最适生长培养基的选择
为确定最适合荧光细菌生长的培养基，将各分离株的标准菌悬液（10⁸ CFU/ml）稀释至10⁻¹至10⁻⁵浓度范围。取10⁻⁴稀释液涂布于三种分离琼脂培养基表面。20°C孵育24 h后，选择对所有分离株产生最高总活菌数的培养基用于荧光细菌的培养[29]。
荧光产生筛选
将各荧光细菌分离株的接种物（5 ml；10⁸ CFU/ml）接种于100 ml SWC肉汤中，20°C培养24 h。所有分离株的初步筛选在暗室中通过395 nm UV照射下的目视评估完成[12]。表现出最高可见荧光的分离株使用发光光谱仪（Perkin Elmer LS-50B，美国）进行二次筛选，激发波长395 nm，测量420至650 nm之间的荧光光谱。发射强度以任意单位（au）表示[30]。
最强产GFP细菌分离株的筛选
筛选基于对二次筛选中选出的细菌分离株绿色荧光蛋白（GFP）的定量和纯度评估。
I. 细菌蛋白提取
按照Meglič等[31]的方法略作调整进行总蛋白提取。细菌沉淀经4000 rpm、4°C离心15 min获得后，悬浮于Tris-HCl缓冲液（pH 7.0，1:4，w/v）中。细胞采用20个循环的超声处理，每次30 s脉冲，振幅20%，间隔30 s以防止热变性。超声后，细胞裂解液再次以4000 rpm、4°C离心15 min，所得滤液作为粗溶性蛋白来源。
II. 总可溶性蛋白含量测定
按照Bradford法（Sigma-Aldrich，Cat. No. B6916）制造商指南测定总可溶性蛋白浓度。使用牛血清白蛋白（BSA）在0.1至1.4 mg/ml浓度范围内生成标准曲线。使用UV-Vis分光光度计在595 nm处读取吸光度，蛋白浓度由相应校准曲线得出[32]。
III. SDS-PAGE分析
可溶性蛋白滤液使用12%分离胶进行SDS-PAGE分析，参照Ebraheem等[18]的方法，使用BlueAQUa™预染蛋白Ladder（Cat No. PM019-500，GeneDirex，台湾，10–180 kDa）作为分子量标记。
IV. GFP定量与纯度评估
从凝胶上小心切取约27 kDa处对应GFP的条带，使用凝胶切片蛋白提取试剂盒（101Bio，Cat. No. BL-P519-Gp）进行洗脱[33]。采用Bradford法测定洗脱GFP的浓度，其纯度以GFP浓度与各样品总可溶性蛋白含量的比值表示[34]。表现出最高GFP浓度和纯度的细菌分离株被选为最强产GFP菌株。
GFP纯度（%）=（GFP浓度/总蛋白浓度）× 100
最强荧光细菌的鉴定
I. 形态学与生化特征
最强荧光细菌的形态学特征基于菌落特征评估，包括形状、边缘、隆起、大小、质地、色素沉着和整体外观。显微特征通过革兰染色后在光学显微镜下观察。细菌运动性采用悬滴法[35]评估，并用半固体深层琼脂确认[36]。鞭毛类型使用透射电子显微镜（JEOL JEM 1200 EXII）按照Hoeniger[37]的方法观察。所选分离株的生化谱使用VITEK® 2自动化系统进行，该系统评估64项生化反应[38]。
II. 分子鉴定
使用DNeasy® Plant Mini试剂盒（Cat.No.69104，Qiagen，德国）按照制造商指南从最高效荧光细菌菌株中提取基因组DNA。使用两个通用细菌引物（正向：5´-AGAGTTTGATCITGGCTCAG-3´；反向：5´-ACGGITACCTTGTTACGA CTT-3´）扩增所选细菌的16 S rRNA基因，扩增方案参照Aneja[35]所述。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上分离，使用1 Kb DNA Ladder（Thermo Scientific，美国）验证预期片段大小。纯化的PCR产物使用自动化DNA测序系统（model 3730XL，Applied Bio Systems，美国）进行测序。获得的序列通过BLASTN（基本局部比对搜索工具）搜索NCBI GenBank数据库进行相似性分析，确定序列相似性和最近的系统发育亲缘关系[39]。
使用BioEdit软件（版本7.0.4.1）将序列与相近菌株序列进行比对以进行系统发育分析。在MEGA版本11中利用最大似然法生成系统发育树。自举支持值按照Felsenstein方法以1000次重复计算[40]。
单因子优化策略（OFAT）优化物理因素
在OFAT策略中，每次仅改变单一变量，同时保持所有其他因素恒定。不同物理因素进行三次重复研究：孵育时间（0、6、12、18、24、30和36 h）、搅拌速度（0 rpm至？rpm，原文未详述上限值）、孵育温度（？°C至？°C，原文未详述范围）和pH（？至？，原文未详述范围）。
研究结果
本研究从埃及亚历山大迈阿密海滩采集的鱿鱼不同解剖部位以及埃及萨法加阿图比亚岛的海水样品中，共分离出11株荧光细菌。在评估的三种分离培养基中，海水完全琼脂培养基（SWC）对荧光细菌的回收率最高。基于荧光的初筛和复筛确定分离株E2为最高效的GFP产生菌。
通过VITEK® 2自动化系统进行表型鉴定和16 S rRNA研究进行基因型鉴定，该菌株被鉴定为Pseudomonas gessardii，相似度为99.34%。16 S rRNA基因序列已提交至GenBank，登录号为OQ285875。
采用单因子一次法（one-factor-at-a-time）优化环境条件后，发现在25°C、pH 7.5、静态条件（0 rpm）下孵育30 h可获得最大GFP产量。这些优化参数使GFP的荧光强度较基础培养基提高了1.51倍。
随后采用双水相系统和快速蛋白液相色谱进行纯化，成功获得高纯度GFP，纯度达96.3%。
讨论与解读
本研究将Pseudomonas gessardii E2菌株鉴定为一种新型海洋来源的高品质纯GFP生产菌株，并建立了有效的生产和纯化策略。研究结果为该GFP在生物成像、生物传感和基于荧光的报告系统中的潜在应用提供了有前景的基础，包括在氧限制环境中的应用。
编译者解读
本研究的意义在于将GFP的来源从传统水母拓展至海洋微生物——Pseudomonas gessardii E2菌株。从方法学角度看，研究者采用了从自然筛选、表型与基因型双重鉴定、单因子优化到双水相系统联合FPLC纯化的完整技术链条，策略清晰且可复制性强。1.51倍的荧光增强和96.3%的纯度数据表明该菌株具备实际应用潜力。值得关注的是，该GFP在静态培养（0 rpm）条件下产量最高，这可能与其天然低氧适应机制相关，也为后续在氧限制环境中的应用提供了线索。局限在于单因子优化未考虑因素间交互作用，未来可结合响应面法进一步提升产量。此外，该GFP的具体光学特性和蛋白结构仍有待深入表征。
参考来源
Mohammed FA, Anter HA, Husseiny SM. Marine-derived Pseudomonas gessardii E2 strain: a novel source of green fluorescent protein with insights into its optimization and purification. Microb Cell Fact. PMID: 41814346.
PMID: 41814346