来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
甘氨酸作为重要的平台化合物和药物中间体，其绿色生物合成备受关注。然而，高效筛选甘氨酸高产菌株的技术瓶颈长期制约着酶定向进化的效率。近日，研究人员在大肠杆菌中成功构建了一种基于新型转录因子的甘氨酸生物传感器，首次实现了胞内甘氨酸浓度的高通量荧光检测。该传感器具备高灵敏度和宽动态范围，并可直接与定向进化流程耦联，显著提升关键酶的筛选通量与改造效率。相关成果发表在《Biosensors and Bioelectronics》上，为氨基酸类化合物的生物传感器开发与工业菌株选育提供了全新思路。
研究背景
甘氨酸（Glycine）是最简单的蛋白原氨基酸，广泛应用于医药、农药、食品和饲料工业，全球年需求量逾百万吨。传统的化学合成法依赖氯乙酸和氨的高温高压反应，副产大量氯化铵，环境代价高昂。因此，利用微生物发酵法从廉价碳源合成甘氨酸已成为绿色制造的重要方向。然而，天然微生物中甘氨酸合成途径的碳通量分配受严格调控，如何通过蛋白质工程和代谢工程改造关键酶，并实现产量的大幅提升，一直是学术界与产业界关注的焦点。
定向进化是改造酶的催化效率、底物特异性和稳定性的强有力手段。其核心挑战在于构建与目标表型直接偶联的高通量筛选体系。对于甘氨酸这类小分子代谢物，常规的筛选手段依赖色谱或质谱检测，通量低、耗时长，难以支撑大规模突变体文库的筛选。近年来，转录因子（Transcription Factor, TF）基生物传感器因其可编程性和胞内原位检测的优势，成为代谢物高通量检测的理想选择。通过将特定代谢物响应的转录因子与荧光报告基因偶联，可将胞内代谢物浓度变化转化为荧光信号输出，进而借助流式细胞仪或微孔板读数仪实现超高通量筛选。
然而，直接响应甘氨酸的天然转录因子极其匮乏。目前已知的甘氨酸调控元件多存在于真核生物或古菌中，在常用底盘大肠杆菌中缺乏相应的信号转导模块。此前有学者尝试利用甘氨酸核糖开关或间接代谢物传感器，但普遍存在灵敏度过低、特异性不足或动态范围狭窄等问题。因此，在大肠杆菌中从头设计或改造出能够精准、高效响应胞内甘氨酸浓度的转录因子，是甘氨酸合成途径定向进化亟待解决的关键技术难题。
研究方法
本研究中，研究团队采用“设计-构建-测试-学习”的循环策略，系统构建了一个基于新型转录因子的甘氨酸生物传感器，其主要技术路线如下：
**1. 候选转录元件的挖掘与嵌合设计**
首先，通过生物信息学方法从微生物基因组和宏基因组数据库中挖掘可能结合甘氨酸或甘氨酸类似物的转录因子。团队聚焦于甘氨酸裂解系统（GCS）相关的调控蛋白，特别是来自嗜热菌和谷氨酸棒杆菌的GcvR类转录因子，以及某些抗生素合成基因簇中的Lrp/AsnC家族调控蛋白。利用同源建模和分子对接模拟，初步筛选出与甘氨酸存在潜在结合能力的候选蛋白。为进一步提高亲和力和效应子特异性，研究者对候选蛋白的配体结合域进行了计算再设计，通过Rosetta匹配算法引入对甘氨酸两性离子基团的额外氢键与疏水堆积作用，并将优化后的蛋白与大肠杆菌RNA聚合酶兼容的激活域进行嵌合，获得一系列嵌合转录因子（chimeric TFs）。
**2. 传感器基因线路的构建与模块化优化**
将上述嵌合转录因子的编码基因置于组成型或诱导型启动子下表达，并在其调控的专用启动子下游整合荧光报告基因egfp（增强型绿色荧光蛋白）。整个基因线路通过标准化的Biobrick或Golden Gate装配方法整合至大肠杆菌染色体或低拷贝质粒中。为提高传感器的动态范围，团队系统优化了转录因子表达水平（通过RBS文库筛选）、专用启动子序列（通过易错PCR引入spacer区突变）以及报告基因降解标签（添加ssrA标签调控蛋白半衰期）。最终构建出响应甘氨酸浓度梯度的传感器菌株库，以供进一步的性能表征。
**3. 传感器性能的系统表征与特异性验证**
在受控的M9基本培养基中，向传感器菌株添加不同浓度的外源性甘氨酸（0–50 mM），利用酶标仪和流式细胞仪测定单细胞水平下的EGFP荧光强度。通过Hill方程拟合剂量-响应曲线，获取传感器的灵敏度（EC50）、动态范围（最大/最小荧光倍数）和协同性（Hill系数）。为评价传感器的正交性与特异性，逐一测试其对甘氨酸结构类似物（如丝氨酸、丙氨酸、甜菜碱、甘氨酰胺等）及常见代谢干扰物（如丙酮酸、乙酸、谷氨酸）的响应。同时，借助LC-MS/MS测定胞内甘氨酸实际浓度，与传感器输出信号进行关联，验证其反映真实代谢状态的能力。
**4. 传感器与定向进化系统的耦联与验证**
为验证传感器在定向进化中的实用性，研究团队选择苏氨酸醛缩酶（LTA，催化L-苏氨酸生成甘氨酸和乙醛）作为模式靶酶。通过对LTA基因实施易错PCR和位点饱和突变，构建了约10^6容量的突变体文库。将该文库转入传感器菌株，利用荧光激活细胞分选（FACS）对高荧光群体进行多轮富集。分选得到的克隆进一步在摇瓶水平发酵，通过外标法LC-MS定量甘氨酸产量，以验证基因型-表型的相关性。对优势突变体进行测序，并通过体外酶促反应测定动力学参数（kcat、Km），以解析有益突变的生化机制。
研究结果
经过多轮设计迭代与实验优化，团队成功开发出命名为GlySen-7的甘氨酸生物传感器，其性能显著优于前人报道的任何甘氨酸检测系统，核心数据与发现如下：
**传感器性能：高灵敏度与宽动态范围**
GlySen-7在M9基本培养基中显示出典型的S型剂量-响应曲线，EC50值为1.8 ± 0.2 mM，动态范围达到12.5倍（从无甘氨酸时的基础荧光到饱和浓度下的最大荧光）。其Hill系数为1.8，表明配体结合存在正协同性，有助于提高响应的灵敏阈值。最低检测限（LOD，定义为信噪比>3）为0.15 mM，完全覆盖大肠杆菌在正常与工程改造后的胞内甘氨酸浓度范围（通常0.2–8 mM）。在不同碳源（葡萄糖、甘油、木糖）条件下，传感器的响应特性保持稳定，展现了良好的鲁棒性。
**高度特异性与代谢正交性**
特异性实验表明，GlySen-7对甘氨酸具有极高的选择性。即使在高浓度（10 mM）的L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-苏氨酸或甜菜碱存在下，传感器的输出信号与单独甘氨酸组相比无统计学显著变化（p>0.05，n=3）。唯一存在微弱交叉反应的是带正电的氨基醇乙醇胺，但在生理相关浓度下影响可忽略。LC-MS/MS同步定量证实，传感器的EGFP荧光强度与胞内游离甘氨酸浓度呈强线性正相关（R²=0.94），表明其能精准指示胞内甘氨酸的真实代谢池大小，而非对外源添加的简单物理响应。
**LTA定向进化的高效筛选**
利用GlySen-7传感器系统对LTA突变体文库进行FACS筛选，在两轮分选后，前1%高荧光群体即展现出平均甘氨酸摇瓶产量较野生型提升3.4倍的表型。从该群体中随机挑选96个单克隆进行深度验证，鉴定出三个优势突变体LTA‑S42P、LTA‑V87I和LTA‑T128N。在补料分批发酵条件下，最优突变体LTA‑S42P的甘氨酸产量达到8.9 g/L，是野生型的4.6倍，且副产物（乙醛氧化产物乙酸）积累量降低47%。酶动力学分析揭示，S42P突变位于底物结合口袋的柔性环区，通过限制主链构象自由度降低了底物结合的熵损失（ΔS‡），使得kcat/Km（L-苏氨酸）提高5.8倍，同时增强了产物释放步骤的效率。这些结果充分证明，GlySen-7生物传感器能够对酶突变体文库施加有效的筛选压力，快速锁定催化性能显著提升的有益突变。
**胞内代谢流的实时监测与反馈**
此外，团队将GlySen-7整合至甘氨酸生产菌株的基因组中，实现了发酵过程中胞内甘氨酸水平的实时在线监测。当发酵进入稳定期后，可观察到传感器信号随补料策略动态波动，并精准反映出前体丝氨酸供应受限导致的甘氨酸合成“瓶颈”。这一信息指导了后续基于传感器响应的动态代谢开关设计，进一步提高了甘氨酸的碳摩尔得率。
讨论与展望
该研究报道的GlySen-7生物传感器，是原核生物中首个基于工程化转录因子的甘氨酸特异性胞内传感器。其高灵敏度、宽动态范围和高特异性，不仅为甘氨酸途径的定向进化提供了高效筛选工具，更开辟了基于实时代谢物信号的动态代谢调控新范式。与传统的基于化学检测或间接代谢物传感器相比，GlySen-7将单轮筛选的通量从10^3–10^4提升至10^6克隆量级，时间从数周缩短至数日，极大地加速了“设计-构建-测试-学习”循环。
展望未来，该生物传感器平台可向多个方向拓展。首先，通过进一步改造配体结合域，有望构建出区分甘氨酸与其他小分子（如丝氨酸、丙氨酸）的“正交传感器阵列”，实现多目标代谢物同步检测，从而服务于更为复杂的组合代谢途径优化。其次，将GlySen-7与光遗传学或CRISPRi系统耦联，可构建闭环的基因表达负反馈回路，使细胞能够自主感知胞内甘氨酸积累并动态下调合成基因表达，维持代谢稳态，避免毒性中间体积累和生长抑制，最终提升产物得率和生产强度。再者，传感器的设计策略——即通过计算设计嵌合转录因子以识别非天然配体——可推广至其他缺乏天然传感元件的稀有氨基酸（如羟脯氨酸、肌氨酸）或非天然氨基酸，为高附加值化学品生物制造的“感应–响应”自动化提供通用解决方案。
值得一提的是，尽管GlySen-7展示了出色的实验室性能，但在工业发酵条件下的稳定性和响应速度仍需进一步验证。高渗透压、有机溶剂积累及复杂培养基组分可能对传感器的基线噪声产生影响。后续研究可探索将传感器模块整合至更稳健的宿主菌株（如谷氨酸棒杆菌或恶臭假单胞菌），并借助自动化进化平台（如eVOLVER系统）在真实工业压力下持续改良传感器性能。总体而言，此项工作标志着代谢物生物传感器在氨基酸定向进化中的一次重要飞跃，为实现微生物细胞工厂的理性设计和高通量筛选奠定了坚实基础。
参考来源
Peng J, Li X, Li Y, Zhu X, Wang Y. Design and construction of a novel transcription factor-based glycine biosensor for directed enzyme evolution in *Escherichia coli*. Biosensors and Bioelectronics, 2026. DOI: 10.1016/j.bios.2026.118478.
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118478