来源：mBio | 编译：DNA Lab Space
食源性病原菌的威胁从未远去。单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽孢杆菌每年在全球造成大量食源性疾病，传统化学防腐剂的局限性促使科学家不断寻找更天然、更安全的替代方案。环状细菌素——一类N端与C端共价连接的核糖体合成抗菌肽——因其结构稳定、抗菌谱广而备受关注。近日，来自爱尔兰和荷兰的研究团队从两株独立分离的枯草芽孢杆菌近缘种中鉴定出一种全新的环状细菌素pumicyclin A，并揭示了其生物合成中一个反直觉的现象：长达32个氨基酸的前导肽缺失至仅剩单个甲硫氨酸，抗菌活性依然保留。
研究背景
食品防腐领域长期面临两难困境。化学防腐剂效果确切，但消费者对"天然"标签的追求日益强烈；天然抗菌肽活性优异，却往往稳定性不足。环状细菌素以其独特的拓扑结构给出了一个折中方案——首尾共价连接使分子更加紧凑，对蛋白酶水解和热变性具有更强的抵抗力。
此前报道的环状细菌素中，pumilarin和pumilarin X均来自枯草芽孢杆菌，而新发现的pumicyclin A与已知环状细菌素amylocyclicin仅有39.1%的氨基酸序列一致性。更值得注意的是，其生物合成基因簇中前导肽长达32个氨基酸，远超多数环状细菌素的典型长度。这种"长前导肽"是否在生物合成中扮演不可替代的角色？研究团队通过系统的缺失突变和位点替换实验，给出了出人意料的答案。
研究方法
菌株鉴定与基因组分析。 研究使用的两株产pumicyclin A的菌株分别为APC4183和MG52，前者分离自爱尔兰，后者分离自荷兰。研究团队对两株菌进行了全基因组测序，并采用平均核苷酸一致性（ANI）分析评估亲缘关系。结果显示两株菌的基因组共享96.28%的ANI值，属于同一物种的不同菌株。次级代谢产物预测使用BAGEL4和antiSMASH两款生物信息学工具完成，两株菌均编码fengycin（抗真菌脂肽）、lichenysin（表面活性剂）和zwittermicin A（聚酮-非核糖体肽杂合体）等次级代谢产物。
基因簇定位与序列分析。 通过基因组挖掘，研究团队定位到pumicyclin A的生物合成基因簇，该基因簇由六个基因组成。前体肽由两部分构成：N端的32个氨基酸前导肽和C端的64个氨基酸核心肽。成熟肽的理论分子量约为6,218 Da。序列比对显示，pumicyclin A与已知环状细菌素amylocyclicin的氨基酸一致性仅为39.1%，与已报道的枯草芽孢杆菌环状细菌素pumilarin和pumilarin X在前体序列和理化性质上均有明显差异。研究团队特意将其命名为"pumicyclin"而非"pumilarin"，以突出其环状结构特征，但并未提议对已发表的pumilarin系列进行追溯性更名。
前导肽功能解析。 为探究长前导肽是否必要，研究团队构建了一系列前导肽缺失突变体。最极端的突变体将前导肽整个删除，仅保留单个甲硫氨酸残基。此外，研究团队还在环化位点附近引入了特定位点替换突变，以评估这些残基对生物合成的影响。原文摘要未详述具体的突变构建方法（如所用载体、转化方法、诱导条件等参数）。
抗菌活性检测。 抑菌谱测定采用琼脂扩散法或微量稀释法（原文摘要未详述具体操作参数），测试菌株涵盖多种革兰氏阳性菌，重点包括李斯特菌属和蜡样芽孢杆菌。
研究结果
两株独立分离菌株产生相同的环状细菌素。 尽管APC4183和MG52分别分离自爱尔兰和荷兰，两株菌却携带几乎完全相同的pumicyclin A生物合成基因簇。ANI分析确认两株菌基因组一致性为96.28%，这一数值略低于同物种典型阈值，但高于常见种间差异水平。两株菌均通过BAGEL4和antiSMASH预测到fengycin、lichenysin和zwittermicin A等次级代谢产物，且预测谱高度相似。
pumicyclin A的抑菌谱。 Pumicyclin A对革兰氏阳性菌表现出广谱抑制活性，尤其对李斯特菌属和蜡样芽孢杆菌具有强效抑制作用。原文摘要未提供具体的MIC值（最低抑菌浓度）或抑菌圈直径数据。
基因簇结构与功能注释。 六基因生物合成簇中，除pumicyclin A前体基因外，第二个下游基因编码一个较小的类细菌素肽。通过基因敲除实验，研究团队证实该下游基因对pumicyclin A的产生并非必需——敲除后pumicyclin A的产量和活性未受影响。这一发现提示该基因可能编码一种独立的小型细菌素，或为冗余的调控元件，但原文摘要未详述该基因产物的具体功能。
前导肽缺失至单甲硫氨酸仍保留活性。 这是本研究最引人注目的发现。将32个氨基酸的前导肽逐步缺失，最终仅保留一个甲硫氨酸残基时，pumicyclin A的抗菌活性依然可被检测到。这一结果强烈表明，对于pumicyclin A而言，长前导肽并非生物合成所必需。这与许多其他环状细菌素形成鲜明对比——在这些体系中，前导肽通常被视为环化酶的识别和锚定区域。
环化位点附近的特定残基不可或缺。 与前导肽缺失实验形成对照的是，环化位点附近的特定氨基酸替换导致了活性完全丧失。研究团队将这种活性丧失归因于生物合成过程受损——可能涉及环化反应中断、分泌受阻或稳定性下降。换言之，虽然前导肽长度可以大幅压缩，但核心肽环化位点附近的残基对正确环化和成熟至关重要。原文摘要未详述具体是哪些氨基酸位点发生了替换。
讨论与展望
Pumicyclin A的发现为环状细菌素家族增添了新成员，但更值得玩味的是其前导肽的"可弃性"。传统观点认为，长前导肽在环状细菌素生物合成中承担识别和定位功能。pumicyclin A的实验数据却表明，前导肽压缩至单甲硫氨酸不影响活性——这暗示该体系中环化酶对前导肽的依赖远低于预期。一种可能的解释是，pumicyclin A的环化酶具有更宽松的底物识别机制，或者核心肽自身的结构特征足以引导环化过程。
这一发现对肽工程具有直接启示。如果前导肽可以大幅缩短甚至近乎删除，那么异源表达系统的设计将更加灵活——更短的前导肽意味着更少的代谢负担和更简便的工程操作。同时，环化位点附近关键残基的鉴定为定点突变改造提供了靶点：想要提高pumicyclin A的稳定性或改变其抗菌谱，这些残基是首要的改造对象。
当然，本研究仍有未解之谜。原文摘要未提供pumicyclin A对李斯特菌的具体抑菌浓度数据，也未详述其作用机制是膜破坏还是胞内靶向。下游小分子类细菌素肽的真实功能、环化酶的底物识别机制等，都有待后续研究揭示。就食品生物防腐的应用前景而言，pumicyclin A的广谱抗革兰氏阳性菌活性和环状结构赋予的稳定性，使其成为值得进一步开发的候选分子。
参考来源
Liu F, Huang X, O'Connor PM, Miceli de Farias F, Buttimer C, et al. Identification and characterization of pumicyclin A, a novel circular bacteriocin from Bacillus pumilus with a dispensable leader peptide. mBio. PMID: 42339835.
PMID: 42339835