来源：mBio | 编译：DNA Lab Space
秸秆水解物中葡萄糖与木糖的同步利用，一直是木质纤维素生物炼制绕不开的关卡。碳代谢物阻遏效应（CCR）让大肠杆菌这类工业菌株优先消耗葡萄糖，木糖只能靠边站。发表于《mBio》的这项研究，没有沿用敲除ptsG的老路子，而是通过删除pgi和gnd基因，迫使葡萄糖改走Entner-Doudoroff（ED）通路，再结合适应性实验室进化（ALE），最终获得一株能同时高效代谢两种糖的大肠杆菌突变株MDE。该菌株不仅能从秸秆水解物中生产丙酮酸，引入budRABC操纵子后还能合成2,3-丁二醇。
研究背景
木质纤维素水解物中，葡萄糖约占60%，木糖约占30%左右。理想状态下，菌株应同时摄取这两种糖，但大肠杆菌的磷酸转移酶系统（PTS）会优先磷酸化葡萄糖，抑制木糖的转运和代谢基因表达。传统破解CCR的手段是敲除ptsG基因——它编码PTS系统的EIIBCGlc组分。然而，这并非唯一出路。
本研究的思路不同。作者在E. coli MG1655中同时敲除pgi（编码葡萄糖-6-磷酸异构酶）和gnd（编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶），前者阻断糖酵解EMP通路，后者切断磷酸戊糖途径（PPP）。如此一来，葡萄糖只能经ED通路代谢，木糖则通过EMP和PPP利用。两条糖的代谢路径在理论上被分开了。
但理论归理论。得到的E. coli MD0菌株在葡萄糖和木糖混合碳源中生长缓慢，原因有二：ED通路代谢葡萄糖速度慢，且CCR仍然抑制木糖利用。于是，研究者用适应性实验室进化来驯化这株菌。
研究方法
菌株构建与培养条件。实验起始菌株为E. coli MG1655，通过基因敲除pgi和gnd获得E. coli MD0。敲除ptsG的大肠杆菌MG1655ΔptsG作为对照菌株。培养温度未在摘要中详述，但按大肠杆菌常规培养条件（37°C）推断——原文摘要未明确给出具体培养温度。
适应性实验室进化（ALE）流程。E. coli MD0最初在含5 g/L葡萄糖、5 g/L木糖和2 g/L葡萄糖酸盐的混合碳源中培养。经过50次传代后，葡萄糖酸盐从培养基中去除，菌株改为在5 g/L葡萄糖和5 g/L木糖中继续传代100次。随后，两种糖的浓度都提高到10 g/L，再传代47次后分离出高效共利用菌株E. coli MDE。
基因敲除验证。为确认代谢路径重构的效果，研究者构建了E. coli MDEΔzwf（敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因）和E. coli MDEΔxylA（敲除木糖异构酶基因），并在10 g/L葡萄糖和10 g/L木糖混合碳源中培养。结果显示，E. coli MDEΔzwf丧失了共利用能力——这证实ED通路是葡萄糖代谢的唯一途径。
基因组分析与突变鉴定。对进化后的E. coli MDE进行基因组测序，鉴定出gntR和xylR基因突变是共利用表型的关键贡献者。这两个基因分别编码葡萄糖酸利用调控因子和木糖利用调控因子。
异源验证。将相同的路径分离策略（敲除pgi和gnd）和关键突变引入产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca），该菌株同样获得了高效的葡萄糖-木糖共利用能力。
副产物基因删除与产物发酵。在E. coli MDE中删除7个副产物合成相关基因，获得菌株E. coli MDE-6。该菌株以秸秆水解物为底物生产丙酮酸。进一步在E. coli MDE-6中导入budRABC操纵子，实现2,3-丁二醇的合成。
分析方法。细胞密度用可见分光光度计（V-5100H，中国）在600 nm波长处测定。葡萄糖浓度用生物分析仪（SBA-40D，中国）检测。木糖、丙酮酸及其他副产物浓度采用高效液相色谱系统（LC-20AT，日本）分析，配备Aminex HPX-87H色谱柱（300 × 7.8 mm，Bio-Rad，美国），流动相为10 mM H₂SO₄，流速0.4 mL/min，柱温55°C。2,3-丁二醇和乙偶姻浓度用气相色谱（GC2014C，日本）测定，使用毛细管色谱柱，具体条件参照文献报道的方法。
研究结果
E. coli MDE的获得与表型特征。经过197次传代（50次+100次+47次），研究者从E. coli MD0出发获得了E. coli MDE。该菌株在葡萄糖和木糖混合碳源中表现出优异的共利用能力，优于对照菌株E. coli MG1655ΔptsG。不同糖比例下的共利用实验表明，E. coli MDE在多种葡萄糖/木糖配比下都能同步消耗两种糖——原文摘要指出其“在各种比例下均表现出稳健的糖共利用能力”，但未提供各比例的具体消耗速率数据。
路径分离的验证。E. coli MDEΔzwf在10 g/L葡萄糖和10 g/L木糖混合碳源中丧失了共利用葡萄糖的能力，而E. coli MDEΔxylA则失去木糖代谢能力。这从正反两方面证实，改造后的菌株中葡萄糖完全依赖ED通路代谢，木糖则走EMP和PPP——两条路径独立运作，互不干扰。
关键突变鉴定。基因组分析锁定gntR和xylR基因突变。gntR编码的调控蛋白通常抑制葡萄糖酸利用基因的表达，其突变可能解除了对相关代谢基因的抑制；xylR编码木糖利用途径的转录激活因子，突变可能增强了木糖转运和代谢基因的表达。原文摘要未详述这两个突变的具体类型（点突变、插入或缺失）及其对蛋白功能的影响机制。
跨菌株验证。将路径分离策略（pgi和gnd敲除）与gntR、xylR突变引入Klebsiella oxytoca后，该菌同样获得了高效的葡萄糖-木糖共利用能力。这表明该策略具有普适性，不局限于大肠杆菌。
产物合成。E. coli MDE-6（删除7个副产物基因）以秸秆水解物为底物，实现了丙酮酸的高效生产。进一步导入budRABC操纵子后，E. coli MDE-6能够从秸秆水解物中合成2,3-丁二醇。原文摘要未提供丙酮酸和2,3-丁二醇的最终产量、产率或生产速率等具体数值。
碳代谢物阻遏的解除机制。在大肠杆菌中，CCR主要通过PTS系统实现——PTS影响cAMP合成，削弱cAMP受体蛋白对木糖转运和分解代谢基因的转录激活。敲除ptsG是消除CCR的常用策略。本研究的路径分离策略绕开了PTS，通过代谢路径的物理分隔实现双糖共利用。E. coli MD0最初在混合糖中生长缺陷明显，可能源于ED通路代谢葡萄糖速率慢，以及CCR对木糖代谢的持续抑制。ALE过程中加入葡萄糖酸盐作为辅助碳源，让菌株在进化初期能够维持基本生长，随后逐步撤去葡萄糖酸盐、提高糖浓度，最终筛选出高效共利用突变株。
讨论与展望
这项研究的价值在于提供了一套可推广的代谢工程策略。传统敲除ptsG的方法虽然能部分解除CCR，但往往伴随葡萄糖转运效率下降等副作用。路径分离策略从代谢网络层面将葡萄糖和木糖的分解路径彻底分开，再通过ALE弥补ED通路代谢速率慢的短板，最终实现双糖同步利用。
gntR和xylR突变的鉴定值得玩味。这两个基因并非传统CCR调控网络的核心组分，它们的突变却能显著改善共利用表型。这说明适应性进化能够触及人工设计难以预见的调控节点——实验室进化不只是性能提升工具，更是发现新调控机制的途径。
将相同策略成功应用于Klebsiella oxytoca，表明该方案具有跨菌株普适性。未来若能在更多工业菌株中验证，或可形成一套标准化的木质纤维素糖共利用工程流程。不过，从秸秆水解物到丙酮酸和2,3-丁二醇的转化效率，仍需更多定量数据支撑——原文摘要未提供产量、产率等具体数值，这是后续研究值得关注的方向。
参考来源
Tan X, Hu Y, Li K, Meng W, Gao K. Pathway remodeling and adaptive evolution enable efficient co-utilization of glucose and xylose in Escherichia coli. mBio. PMID: 42446233.
PMID: 42446233