来源：Bioprocess Biosyst Eng | 编译：DNA Lab Space
导读
第二代生物乙醇的工业化进程长期受制于纤维素酶的高成本。本研究以嗜热真菌 Myceliophthora thermophila I-1D3b 为核心，在多层填充床生物反应器中系统评估了批式与连续两种操作模式下的固态发酵产酶性能，并整合了酶提取、浓缩与稳定化全流程。连续操作显著提升了各发酵模块间的酶活均一性，硫酸铵沉淀实现78.7%的酶活回收率。该集成策略为木质纤维素生物炼制厂的就地产酶提供了可行的技术路径。
研究背景
循环生物经济主张将有机副产物转化为能源、生物材料和高附加值生物产品。木质纤维素生物炼制厂作为关键平台，通过整合生物技术与物理化学路线提升资源效率。第二代生物乙醇的可行性高度依赖高效的纤维素酶——然而商品酶制剂的高成本长期制约着该产业的经济性。
原位产酶策略应运而生。固态发酵（SSF）凭借直接利用农业工业副产物、低水耗等优势，成为产酶的重要平台。在各类生物反应器构型中，填充床系统因设计简洁而备受关注。但热传递受限、反应器操作复杂以及下游处理瓶颈，仍是大规模应用的主要障碍。本研究旨在系统评估多层填充床生物反应器在批式和连续两种模式下，以蔗渣与麦麸为底物生产内切葡聚糖酶的全流程集成表现。
研究方法
微生物与底物
产酶菌株为嗜热真菌 Myceliophthora thermophila I-1D3b，最初分离自巴西 Usina Guarani 的蔗渣堆，前期摇瓶和反应器实验已证实其高产纤维素酶性能。
孢子制备：菌株接种于含60 mL Sabouraud Dextrose Agar (SDA) 培养基的锥形瓶斜面，在生化需氧量培养箱（Model SL 200, Solab, Brazil）中45 °C培养至少48 h以完成菌丝生长和产孢。随后用100 mL无菌营养液轻轻刮取琼脂表面孢子。该营养液 pH 调至5.0，组成（w/v）为：0.35% (NH₄)₂SO₄、0.30% KH₂PO₄、0.05% MgSO₄·7H₂O、0.05% CaCl₂、0.10% Tween 20。孢子悬浮液标准化为每克干固体（g.d.s）1 × 10⁷个孢子。
固体底物选用蔗渣（SCB）和麦麸（WB），二者成本低、区域供应充足，且为固体基质提供有利的营养和结构条件。SCB 由 Usina Ipiranga Agroindustrial S.A.（Brazil）提供，WB 购自当地供应商（Agropecuária Claro, São Carlos, SP, Brazil）。SCB 先在鼓风干燥箱（Model 035, Marconi, Brazil）中60 °C干燥至含水量10–15%（水分分析仪 M5 Thermo, Bel Engineering, Monza, Italy 测定），过筛（5 × 5 mm 和 4 × 2 mm 网孔）。麦麸直接使用，含水量12%（湿基），平均粒径最大1.8 mm。
填充床生物反应器固态发酵
SSF 实验在填充床生物反应器（PBB）中进行。该系统为不锈钢材质，由底部带孔的圆柱形模块组成，模块长10 cm、内径13 cm、外径15 cm。每个模块的环形空间用作水夹套，实现床层温度控制并缓解填充床 SSF 中常见的过热现象。
过程空气由压缩机供给，依次经过针阀、生物过滤器、AppliTech® 流量计（Asa, Italy），进入填充玻璃珠的夹套柱。玻璃珠间空隙填充蒸馏水并维持在操作温度，使空气在进入反应器前达到饱和——该策略旨在减少 SSF 过程中床层过度干燥。反应器出口的渗透气体经过除湿系统：冷凝收集器连接接收瓶，随后通过硅胶柱（直径5.2 cm，高39 cm）。该装置将出口空气相对湿度降至15%以下，满足 Vaisala Carbocap 探头（Vantaa, Finland）准确测量 CO₂ 浓度的要求。
反应器垂直放置，含入口模块（IL）和出口模块（OL），两者均带夹套，外部尺寸与中间发酵模块相同，但内部为锥形几何结构。操作时空气自下而上流过固定床。位于系统底部的入口模块填充玻璃珠以促进均匀布气，出口模块留空便于气体流动。另有两个辅助模块分别填充湿粗蔗渣（IAL）和干粗蔗渣（OAL），用于减少发酵模块水分过度散失并吸收出口模块壁面冷凝水分。每个辅助模块填充90 g粗蔗渣。
操作温度维持在45 °C——该温度已被报道为 M. thermophila 内切葡聚糖酶生产的最适温度。发酵时间96 h。实验期间，过程空气与循环水均通过模块和水浴夹套维持在45 °C（恒温水浴 model SL-152, Solar, Brazil），渗透空气流量固定为250 L h⁻¹，以增强氧传递并维持床层适宜水分条件。
发酵温度曲线用 T 型热电偶实时监测，热电偶通过法兰安装在每个发酵模块的入口和出口，探头尖端位于模块径向中心，全程记录床层内部温度变化。信号由 National Instruments COMPAQ-DAQ 数据采集系统记录，LabVIEW 软件（National Instruments, Austin, USA）运行控制程序。
模块添加、移除和重新定位期间，固体底物会短暂暴露于实验室环境。所有操作均在无菌条件下进行以降低微生物污染风险。底物与营养液分别经121 °C、20 min高压灭菌。冷却后在紫外灭菌的层流柜中与孢子悬浮液混合均质。空气过滤器和加湿装置在每次发酵前均灭菌。
发酵培养基为 SCB 与 WB 按 7:3（w/w）混合，与 M. thermophila I-1D3b 前期研究一致。含水量调至75%（湿基），添加营养液和接种物悬浮液使孢子浓度达每克干固体1 × 10⁷个。每个发酵模块填充130 g干底物。
操作模式
为评估操作模式（批式和连续）对生物过程的影响，两种构型均开展发酵实验，连续操作分为上行和下行两种方式。
批式培养中，PBB 在发酵开始时装配全部发酵模块，保持同一构型直至96 h终点。该条件作为与连续模式对比的参考。4天发酵使用4个发酵模块，编号 L1、L2、L3、L4。
连续模式下，模块每24 h逐一添加，经接种、装填、耦合至 PBB。初始阶段床层高度逐步增加，直至最先插入的模块达到指定停留时间。此后系统进入稳态操作——移除已发酵模块与添加新接种模块同步进行。模块运动方向可为上行（底部进料、顶部出料）或下行（顶部进料、底部出料），取决于操作策略。
研究结果
发酵过程中的热行为
热调控是填充床生物反应器运行的主要技术挑战之一，代谢热积累可能损害酶稳定性及发酵过程均一性。本研究考察了批式和连续操作对 M. thermophila I-1D3b 在木质纤维素底物（SCB:WB = 7:3 w/w）上产内切葡聚糖酶过程中床层热行为的影响。图3显示了批式（图3a）、上行连续（图3b）和下行连续（图3c）三种模式下四个发酵模块的温度时间演变。
如图3所示，整个发酵期间记录的平均温度接近45 °C，各监测点间波动小于4 °C。批式操作下观察到初始温度上升，随后出现热峰并趋于稳定或略有下降——这与固定床系统中代谢热瞬时积累的行为一致。轴向温度梯度的形成与单向通气内在相关，表现为温度沿反应器长度的离散分布。尽管过热程度轻微，梯度的持续存在可能影响床层内氧传质和蒸发速率。
连续操作下（图3b和c），热曲线比批式模式表现出更频繁的振荡，反映了发酵模块在整个过程中的间歇性移动。尽管存在这些波动，温度仍保持在批式操作观察到的相似范围内，无显著热过载迹象。在96至210 h之间，每24 h添加和移除一个模块，系统沿塔体逐级推进模块，行为接近活塞流反应器。这与 Mitchell 等人的观点一致——连续 PBB 操作可能促进床层沿程过程条件的更大均匀性。
各操作模式的最大温度和平均温度相近：峰值温度分别为48.2 ± 0.6 °C（批式）、48.9 ± 0.7 °C（上行连续）和47.8 ± 0.8 °C（下行连续）；平均温度分别为44.7 ± 0.3、44.5 ± 0.4 和44.5 ± 0.5 °C，差异无统计学意义（p > 0.05）。结果表明，在评估条件下两种操作模式均使系统保持在期望温度范围附近，无严重过热。
温度维持在接近最适范围，提示高床层孔隙率、嗜热微生物的选用以及模块移动策略的组合有利于代谢热消散。本研究中床层孔隙率为0.764，高于 Perez 等人在蔗渣-麦麸体系中报道的0.55（该研究中温度上升约3 °C）。相比之下，Ghildyal 等人在 PBB 中用 Aspergillus niger 培养于麦麸时报道了15 °C的温度升高。综合比较证实，床层物理结构在固态发酵热消散和温度梯度强度中起决定性作用。
除操作模式外，新模块的引入位置同样影响反应器热曲线。图3c显示新鲜接种模块从反应器上部加入时连续发酵的热行为——温度峰值集中在 PBB 上部区域，与图3b中峰值出现在床层下部和中部的曲线形成对比。该差异表明新接种模块的占据位置直接影响系统内热量的空间分布。
在图3c中，每24 h记录到的温度下降反映了模块添加、移除和移动的时刻，表征了连续操作间歇性特征。由于新模块插入发酵区上部位置，热峰优先出现在反应器较高位置，而靠近空气入口的位置随时间的温度变化较小。该行为说明模块进料策略改变了 PBB 中的纵向热分布，应在系统操作设计中予以考虑。然而，由于与下游系统集成相关的操作限制，本研究后续连续实验均采用上行模式，即模块从反应器下部添加。
酶活与含水量
批式和上行连续操作下评估了内切葡聚糖酶活性和发酵模块的最终含水量，如图4a和b及表1所示。这些变量的控制对 PBB 性能至关重要——低于10%的水热梯度可使酶生产率降低30–50%。
批式和连续操作的平均内切葡聚糖酶活性相近，分别为95.63 ± 28.37 和 96.36 ± 4.63 U·g.d.s⁻¹。尽管均值相似，连续过程中观察到的较低离散度表明发酵模块间酶活的空间均一性更高。因此，两种操作模式的主要差异在于过程的空间均匀性，而非平均产酶水平。
连续操作下的均一性与批式模式下更大的离散形成对比——后者可归因于静态系统中水分、温度和氧可用性的局部异质性——这从操作角度看代表了更高的过程鲁棒性和可预测性。这种更高的均匀性与模块沿反应器的渐进移动有关，使所有模块随时间暴露于热梯度和水分梯度的所有区域。根据 Mitchell 等人的观点，连续操作下 PBB 趋向于活塞流反应器行为，有利于各层更均匀地暴露于系统内的气相和热条件。
这些结果与 Rodrigues 等人的报道一致，后者同样观察到 M. thermophila I-1D3b 在 PBB 中（SCB:WB = 7:3 w/w）连续发酵时内切葡聚糖酶活性的更高均一性。
除酶活外，床层含水量也是系统关键因素——水分含量下降直接损害 SSF 中真菌生长和代谢活性。固体基质最终含水量（湿基百分比）见表1。
CO₂ 浓度监测
图5显示了批式模式（a）和连续模式（b）下 PBB 出口气流中 CO₂ 浓度的重复曲线。CO₂ 浓度作为微生物代谢活性的实时指标，反映了两种操作模式下底物消耗和产物形成的动态变化。
连续模式下的酶回收
图6显示了连续操作下 M. thermophila（SCB:WB = 7:3 w/w）在 PBB 中固态发酵获得的每模块内切葡聚糖酶活性和回收率。提取流量分别为（a）180 L h⁻¹ 和（b）2400 L h⁻¹。下标"E"表示通过渗透回收的酶活，无下标数值表示渗透固体补充提取后的残余酶活。提高渗透水流速显著增强了酶回收效率，表明传质是下游性能的关键限制因素。
连续渗透提取循环
图7显示了 Myceliophthora thermophila I-1D3b 发酵底物（蔗渣:麦麸 = 7:3 w/w）每次连续渗透提取循环回收的内切葡聚糖酶活性。柱状图代表平均值 ± 标准差（n = 3）。不同字母表示 Tukey 检验差异显著（p < 0.05）。
酶浓缩与沉淀
图8显示了内切葡聚糖酶活性与（a）硫酸铵饱和度、（b）乙醇浓度的关系，以及（c）60%和70%饱和度硫酸铵沉淀内切葡聚糖酶的动力学曲线。硫酸铵沉淀性能优于乙醇，从粗提液中回收总酶活单位的78.7%，活性达156 U·g.d.s⁻¹；而乙醇在评估条件下导致显著的酶活损失。
讨论与解读
本研究证实了 Myceliophthora thermophila I-1D3b 在多层填充床生物反应器中以蔗渣和麦麸为底物进行固态发酵产内切葡聚糖酶的技术可行性与可重复性。连续操作降低了床层内异质性，促进了发酵模块间酶活均匀性的提升，且未牺牲平均产量。热曲线保持在物种最适范围附近，最高温度分别为48.2 °C（批式）和48.9 °C（连续），表明连续操作未损害系统稳定性。在浓缩策略中，硫酸铵沉淀表现优异，回收率达78.7%，活性为156 U·g.d.s⁻¹；乙醇在测试条件下导致净酶活损失。沉淀提取物表现出高热稳定性，60 °C孵育24 h后仍保留约92%的活性。综合来看，热控制、渗透提取与下游处理的集成对于该平台在二代乙醇链中原位产酶的鲁棒性和适用性至关重要。未来研究应在中试规模验证这些条件，并探索互补的纯化策略。
编译者解读
该研究的核心价值在于"集成"——将产酶、提取、浓缩三个环节在单一平台中贯通，直接回应了固态发酵从实验室走向工业化的关键瓶颈。连续操作配合模块移动策略巧妙地化解了填充床反应器"一锅端"的批次局限，使系统兼具活塞流反应器的均一性和连续生产的效率。硫酸铵沉淀对乙醇的明显优势提示，下游工艺选择必须基于实际物料体系验证，而非惯性沿用。一个值得注意的局限是：当前数据仍以摇瓶和实验室规模反应器为基础，中试放大时的传热传质行为可能显著偏离现有结论。从合成生物学视角看，若将该平台与产酶菌株的基因工程改造（如启动子优化、分泌途径强化）相结合，有望进一步释放固态发酵的产能潜力。
PMID: 42370983