DNA去甲基化使转录抑制因子SlSPL-CNR

来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space

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导读

DNA甲基化降低通常与基因激活相关联。本研究揭示了一种相反机制：在番茄果实成熟过程中，DEMETER-LIKE 2（SlDML2）介导的DNA去甲基化使转录抑制因子SlSPL-CNR得以结合靶基因启动子，从而抑制基因表达。通过DAP-seq、ampDAP-seq、结构生物学和CRISPR敲除等实验，作者证明SlSPL-CNR对甲基化敏感，优先结合未甲基化的GTACGG基序，并调控果实风味酯类代谢。该机制在水稻、玉米和番茄中保守存在。

研究背景

基因组DNA甲基化是保守且被广泛研究的表观遗传修饰，指甲基基团（–CH₃）共价添加到胞嘧啶第五位碳原子上（5-mC）。植物中DNA甲基化可发生在所有胞嘧啶序列环境中，包括对称的CG、CHG和非对称的CHH序列。精确的DNA甲基化调控对X染色体失活、转录控制、基因组印记、转座子沉默和染色体稳定性维持等众多生物学过程至关重要。

近期研究表明，DNA甲基化动态对肉质果实成熟至关重要。在番茄果实成熟过程中，SlDML2介导的DNA去甲基化发生在超过20,000个基因组区域，这种DNA甲基化丢失间接促进了主调控因子RIN对其部分靶启动子的访问。然而，成熟诱导的去甲基化是否直接改变转录因子与DNA的识别，此前尚未得到验证。转录因子通过结合特定的顺式调控模块来调控下游靶基因，而DNA甲基化可改变转录因子的结合能力，这一机制在植物中的具体作用有待阐明。

研究方法

植物材料与生长条件

本研究使用野生型（WT）番茄品种AC（Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig），以及CRISPR/Cas9敲除突变体（slcnr-1、slcnr-2）和转基因株系（pCNR::gCNR-3xFLAG和pDML2::gDML2-3xFLAG，均为AC背景）。植物在受控环境生长室中培育，光周期为16小时光照/8小时黑暗，白天温度26–28 °C，夜间温度18–20 °C，相对湿度65%。CRISPR/Cas9载体构建和植物转化按照已建立的方案进行。每个发育阶段采集三个独立的生物学重复（每个重复6个果实）。本研究所用引物序列见补充数据10。

实时RT-PCR分析

使用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme, RC411）从番茄果实组织中提取总RNA。使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR Kit（Vazyme, R223）按照制造商方案合成互补DNA。cDNA稀释五倍后，取2 µL模板用于20 µL qPCR反应体系，含ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme, Q711）。所有反应均设置三个生物学重复。

DNA亲和纯化测序（DAP-seq）和ampDAP-seq

DAP-seq按照已建立的方案进行。使用Plant DNAzol Reagent（Invitrogen, 10978021）从成熟WT果实（46 dpa）中提取基因组DNA，通过Bioruptor Plus（Diagenode, UCD-300）超声打断至250–600 bp片段。打断后的DNA依次进行末端修复（End-It DNA End Repair Kit, Lucigen, ER0720）、加A尾（Klenow Fragment 3′→5′ exo-, NEB, M0212L）和Y型接头连接（T4 DNA Ligase, Promega, M1804）。对于ampDAP-seq，取15 ng接头连接DNA进行12个PCR循环以消除甲基化。将SlSPL-CNR开放阅读框克隆到pIX-Halo载体中，使用TNT SP6偶联小麦胚芽提取系统（Promega, L4130）在37 °C下体外表达2小时。使用Magna HaloTag Beads（Promega, G7282）在室温下纯化Halo标记蛋白1小时；空载体作为模拟对照。蛋白-DNA结合反应体系含150 ng DNA文库，在25 °C孵育60分钟。结合DNA在95 °C洗脱10分钟，使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme, P521）和带索引的Illumina引物进行扩增。PCR产物用VAHTS DNA Clean Beads（Vazyme, N411）纯化并筛选200–600 bp片段，然后在Illumina NovaSeq 6000平台（上海植物逆境生物学研究中心基因组核心设施）上测序。

全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和数据分析

使用Plant DNeasy Mini Kit（QIAGEN, 69106）从不同发育阶段的WT果实中提取全基因组DNA。提取的基因组DNA提交至中国科学院上海植物逆境生物学研究中心基因组核心设施，进行全基因组重亚硫酸盐转化、文库构建和Illumina NovaSeq 6000高通量测序。

原始150 bp双端读段使用fastp（v0.12.4）进行质量控制，去除接头序列并修剪低质量碱基（Phred质量分数< Q15）。随后使用FastQC（v0.11.9）进行质量评估，确认接头完全去除。清洗后的读段使用Bismark（v0.23.0）比对到番茄参考基因组（SL4.0），参数为“-N 1”，允许种子比对时有一个核苷酸错配。使用Bismark中的deduplicate_bismark模块去除PCR重复，并使用bismark_methylation_extractor模块提取各胞嘧啶环境（CpG、CHG、CHH）的甲基化信息。仅保留至少覆盖4个读段的胞嘧啶进行下游分析。每个胞嘧啶的甲基化水平计算为含胞嘧啶（C）的读段数除以覆盖该位置的总读段数（C + T（胸腺嘧啶））。基因组区域的平均甲基化水平使用公式∑C/∑(C+T)计算。重亚硫酸盐转化效率通过计算叶绿体DNA（无甲基化，作为内部对照）中胞嘧啶的非转化率来评估。甲基化信息转换为BedGraph格式，随后使用UCSC工具的bedGraphToBigwig（v2.8）转换为BigWig文件，用于Integrative Genomics Viewer（IGV）可视化。差异甲基化分析使用R包methylKit进行。WT-Br和WT-green之间的甲基化差异使用calculateDiffMeth函数评估。q值< 0.05的胞嘧啶被视为显著差异甲基化。应用环境特异性甲基化差异阈值（CG ≥ 20%，CHG（H = A、T或C）≥ 10%，CHH ≥ 5%）来分类高甲基化和低甲基化胞嘧啶，统称为差异甲基化胞嘧啶（DMC）。

电泳迁移率变动分析（EMSA）

EMSA按照已建立的方案进行。将SlSPL-CNR的开放阅读框和本研究使用的所有SBP结构域序列扩增并克隆到pET-Sumo载体中。将这些载体转入大肠杆菌（BL21），在16 °C孵育16小时。使用His-tag Purification Resin（BeyoGold, P2221）按照说明书纯化蛋白。DNA探针在5′端用Cy5或FAM标记。标记探针和纯化蛋白在结合缓冲液（18 mM Tris–HCl, 4.5%甘油, 16 mM MgCl₂, 1.6 mM DTT, 35.4 ng/µL BSA）中于30 °C孵育20分钟。反应混合物在4 °C下于0.5× TBE缓冲液中的6%天然聚丙烯酰胺凝胶上电泳，100 V运行1.5小时。凝胶使用FLA-9000扫描仪（Fujifilm, 日本）可视化。

等温滴定量热法（ITC）测定

ITC分析使用先前验证的实验方案进行。将SlSPL-CNR的开放阅读框及其SBP结构域克隆到pET-Sumo载体中。重组蛋白在大肠杆菌（BL21）中表达，并使用His-tag Purification Resin（BeyoGold, P2221）按照制造商方案纯化。通过Ulp1切割去除His-Sumo标签，随后进行二次亲和纯化。纯化蛋白在缓冲液（100 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl, pH 8.0, 2 mM β-巯基乙醇）中透析，并调整至40–50 µM。DNA寡核苷酸在相同缓冲液中重悬至700–900 µM。滴定在20 °C下使用MicroCal PEAQ-ITC（Malvern Panalytical, 英国）进行，数据用Origin 7.0软件分析。详细数据见补充数据3。

染色质免疫沉淀（ChIP）测序

ChIP-seq在绿色（30 dpa）和破色（38 dpa）阶段收获的WT和pCNR::gCNR-3xFLAG转基因果实上进行。对于通过western blotting分析的Tag株系，从0.2 g样品中提取的浓缩蛋白与6× SDS–PAGE上样缓冲液混合，在95 °C变性10分钟，在10% SDS–PAGE凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上。膜与anti-flag（Sigma-Aldrich, F3165, 1:5000）或anti-Actin（植物特异性）（ABclonal, AC009, 1:10,000）一抗在4 °C孵育过夜，随后与anti-mouse二抗（ABclonal, #AS003, 1:10,000）孵育。使用Basic ECL电化学发光试剂盒（ShareBio, WB001）检测信号。

染色质免疫沉淀按照已建立的方案进行，并做了少量修改。果实果皮组织用1%甲醛交联10分钟，在室温下用0.2 M甘氨酸淬灭5分钟。约0.（原文此处截断）

研究结果

SlSPL-CNR在体外偏好结合低甲基化基因组区域

DAP-seq可在保留天然5-mC的同时高效鉴定体外转录因子结合位点，而ampDAP-seq通过PCR扩增几乎去除所有胞嘧啶甲基化。DAP-seq、ampDAP-seq和DNA甲基化组数据的整合分析可揭示转录因子在甲基化位点的结合情况。

为表征SlSPL-CNR对基因组DNA结合的甲基化敏感性，作者首先使用从46天开花后（dpa）成熟果实制备的基因组DNA（gDNA）文库进行DAP-seq（称为CNR-DAP），并使用扩增文库进行ampDAP-seq（称为CNR-ampDAP）（图1a）。同时，对46 dpa的野生型果实进行WGBS，以生成全面的DNA甲基化图谱（称为WT-Red）。CNR-DAP和CNR-ampDAP在重复之间表现出高度可重复性，分别检测到103,923和111,371个结合峰（图1a）。与随机区域对照相比，这些峰在基因区域以及转录起始和终止位点周围显著富集（图1b、c）。从头基序分析确定了三个核心基序GTACGG、GTACTT和GTACNA（N表示任意核苷酸碱基），其中“GTAC”是CNR-DAP中统计富集程度最高的序列，这与SPL家族通常相关的结合特征一致（图1d）。此前研究报道SlSPL-CNR可结合SlAP2a、SlCRE1-2和SlTCP18的启动子，这些靶标均被CNR-DAP成功捕获（图1e）。因此，两种条件下产生的结合谱为分析5-mC如何影响SlSPL-CNR在番茄基因组中的招募奠定了坚实基础。

为评估DNA甲基化对SlSPL-CNR结合的影响，作者整合分析了CNR-DAP、CNR-ampDAP和DNA甲基化组数据。在总共213,326个峰中，根据相对信号强度将26,317个分类为DAP增强型、58,741个为稳定型、128,268个为ampDAP增强型（图2a、b）。大量ampDAP增强峰表明，与CNR-DAP相比，CNR-ampDAP中SlSPL-CNR结合出现了大规模增加。考虑到ampDAP文库缺乏mC修饰，作者推测SlSPL-CNR结合的增益可能源于CNR-ampDAP中DNA甲基化的丢失。与此一致，ampDAP增强峰比稳定峰表现出显著更高的甲基化水平（图2c）。作者进一步量化了所有结合区域中CNR-DAP与CNR-ampDAP信号比与甲基化水平的关系。该分析显示出显著的负相关（r = −0.48），即DAP与ampDAP结合信号比随DNA甲基化水平升高而降低（图2d）。这些结果表明，ampDAP增强峰源于高甲基化区域，这些区域在5-mC去除后变得可及，说明SlSPL-CNR偏好结合未甲基化DNA。对代表性位点的检查证实了这一模式：低甲基化区域在两种测定中均显示转录因子结合，而高甲基化区域仅在CNR-ampDAP中显示结合（图2e）。

此前研究强调了DNA结合基序内胞嘧啶对甲基化敏感性的潜在影响。考虑到从头注释的SlSPL-CNR核心基序“GTACGG”含有多个胞嘧啶（图1d），作者研究了基序甲基化是否调节结合。作者观察到，与稳定峰相比，ampDAP增强峰表现出甲基化基序的显著富集（图2f）。对于排名最高的注释基序序列“GTACGG”，作者通过扫描番茄基因组中的基序匹配位点，评估了每个胞嘧啶位置（1、4、5和6）的甲基化效应，并将位置特异性甲基化与CNR-DAP与CNR-ampDAP信号比相关联。所有四个位置在5-mC掺入后均显示结合减少，其中感觉链上第4位（5-mC4；r = −0.59）的抑制作用最为显著（图2g），将该残基确定为甲基化敏感性SlSPL-CNR结合的关键决定因素。

GTAC-box中的胞嘧啶甲基化降低SlSPL-CNR的DNA结合亲和力

为进一步研究5-mC是否以及在多大程度上抑制SlSPL-CNR与GTAC-box核心基序的直接结合，作者使用15-bp DNA探针（GTAC-box1）进行了电泳迁移率变动分析（EMSA），探针包含未甲基化、半甲基化（仅感觉链上的5-mC）和全甲基化（两条链上的5-mC）“GTAC”基序序列（图3a）。EMSA结果表明，全长SlSPL-CNR及其SBP结构域（氨基酸46–136，aa 46–136）均能有效结合未甲基化DNA探针，但无法结合GTAC-box处半甲基化或全甲基化胞嘧啶的探针（图3b）。这些结果表明，GTAC-box中的5-mC可降低SlSPL-CNR的DNA结合亲和力。

SlSPL-CNR SBP结构域与GTAC-box1P复合物的晶体结构

为阐明5-mC抑制SlSPL-CNR结合的分子机制，作者解析了SlSPL-CNR SBP结构域（aa 46–136）与含GTAC基序的DNA片段（GTAC-box1P）复合物的晶体结构（图4a、b）。总体结构显示，SBP结构域通过带正电的DNA结合界面捕获GTAC-box1P（图4c）。结构细节揭示了SlSPL-CNR SBP结构域与DNA之间的广泛相互作用网络（图4d）。对DNA磷酸骨架的识别涉及多个残基的氢键相互作用（图4e–i），而对DNA碱基的识别则通过特异性氢键和水分子介导的相互作用实现（图4j–m）。

关键发现来自对第4位胞嘧啶（C7）的建模分析：将C7建模为甲基化胞嘧啶后，引入的甲基基团会与Gln94产生空间位阻冲突（图4n），从而从结构上解释了SlSPL-CNR蛋白偏好未甲基化DNA的原因。这一结构观察与EMSA和ITC实验结果一致，共同确立了甲基化敏感性结合的分子基础。

SlSPL-CNR在体内优先结合低甲基化染色质区域

为验证SlSPL-CNR在体内是否也偏好结合低甲基化区域，作者在绿色（30 dpa）和破色（38 dpa）阶段的果实中进行了BrChIP-seq分析。RT-qPCR结果显示SlSPL-CNR在根、茎、叶、花以及不同发育阶段果实中均有表达（图5a）。CNR-BrChIP峰与CNR-DAP峰的重叠百分比随基序得分增加而升高（图5b）。热图显示，在ChIP特有峰和ChIP-DAP共有峰区域，CNR-BrChIP、CNR-DAP、染色质可及性（DHS）和组蛋白修饰（H3K4me3、H3K27ac）信号均富集，而DAP特有峰缺乏这些染色质特征（图5c）。精确率-召回率曲线表明，位于DHS区域内的CNR-DAP峰比单独的CNR-DAP峰能更准确地预测CNR-BrChIP峰（图5d）。AUPRC值进一步证实了这一结论（图5e）。IGV快照显示，共有峰与增加的DHS、H3K4me3和H3K27ac信号相关，而DAP特有峰缺乏这些染色质特征（图5f）。

SlSPL-CNR直接抑制SlAAT1表达从而调控酯类代谢

为探索SlSPL-CNR在体内的直接靶基因及其对果实代谢的调控作用，作者分析了SlSPL-CNR结合位点处GTACGG基序的C₄甲基化动态。在3414个高置信度CNR-BrChIP峰中鉴定出3080个5′-GTACGG-3′位点。根据破色期与绿色期之间C₄位点的甲基化变化，将位点分为稳定C₄（|Δmeth| ≤ 0.10，n = 2662）、高C₄（Δmeth ≥ 0.20，n = 57）和低C₄（Δmeth ≤ –0.20，n = 190）（图6a）。

基因集富集分析（GSEA）显示，低C₄位点在破色期CNR结合更强的区域中显著富集，富集分数（ES）为0.35（图6b）。在前沿子集中，作者注意到SlAAT1基因——一个编码醇酰基转移酶的基因，负责酯类生物合成的最后一步。SlAAT1的转录水平在17、25、34（破色期）和42 dpa果实中呈现动态变化（图6c）。IGV轨迹显示SlSPL-CNR在SlAAT1启动子处有ChIP-seq结合信号，且该区域的GTAC基序在破色期发生去甲基化（图6d）。

EMSA实验证实，SlSPL-CNR能结合SlAAT1启动子中65-bp的未甲基化探针（ProAAT1-GTAC），但无法有效结合半甲基化探针（meProAAT1-GTAC；反义链上有两个5-mC）（图6e）。双荧光素酶实验表明，SlSPL-CNR抑制SlAAT1启动子活性（ProAAT1为1586-bp的SlAAT1启动子片段）（图6f）。RT-qPCR分析显示，在破色期，slcnr-1/2突变体果实中SlAAT1的相对转录水平显著高于WT（图6g）。代谢组分析显示，slcnr-2突变体果实中五种差异酯类代谢物的总相对含量显著高于WT（图6h），其中氨基甲酸甲酯和丙酸2-甲基-1-甲基乙基酯两种酯类代谢物在突变体中含量显著上升（图6i）。这些结果表明，SlSPL-CNR通过直接抑制SlAAT1表达来调控果实酯类代谢物的生物合成。

甲基化敏感性结合在SBP蛋白中保守存在

为评估甲基化敏感性结合是否在植物SPL家族中保守，作者构建了番茄（16个SPL）、水稻（3个SPL）、玉米（3个SPL）和拟南芥（16个SPL）中SPL家族成员的系统发育树（图7a）。保守残基（Q94、Q95）用红点标示。功能注释显示这些SPL转录因子在番茄、水稻和玉米中具有多样的功能（图7b）。

EMSA实验表明，来自水稻和玉米的SBP结构域蛋白对未甲基化GTAC探针（GTAC-box1）表现出强烈的结合，但对半甲基化（hm）和全甲基化（fm）探针的结合显著减弱（图7c）。His标签蛋白作为阴性对照。这些结果表明，甲基化敏感性DNA结合在单子叶和双子叶植物的SBP蛋白中保守存在，暗示这一调控机制在被子植物中具有普遍性。

讨论与解读

DNA甲基化在发育和环境响应过程中持续被重写，但转录因子如何感知这些表观遗传变化仍不明确。本研究证明番茄SPL蛋白SlSPL-CNR被其核心基序GTACGG内的5-mC直接排斥。单个甲基基团足以与SBP结构域中的Gln94产生空间位阻冲突，在体外消除结合并在体内减少占据。这确立了SlSPL-CNR作为甲基化敏感型抑制因子的身份，并首次为植物特异性SPL转录因子的甲基化依赖性调控提供了实验证据。传感残基（Gln94/95）在被子植物SPL中不变，来自水稻（如OsSPL14）和玉米（如ZmSPL15）的直系同源物表现出相同的甲基化诱导结合丧失，表明整个农业重要家族都具备读取DNA甲基化状态的能力。

此前研究已确立Cnr表观等位基因——由SlSPL-CNR启动子内的高甲基化定义——作为表观遗传调控番茄果实成熟的典型范例。然而，SlSPL-CNR功能缺失突变并不能完全重现Cnr表观等位基因的严重成熟缺陷，暗示SlSPL-CNR缺失单独不足以解释Cnr表型的完整分子病因。本研究的发现揭示了甲基化敏感性在不同物种间的保守性，为理解表观遗传变异如何通过转录因子感知并转化为代谢输出提供了新视角。

编译者解读

本研究巧妙地将DAP-seq/ampDAP-seq差异分析、晶体结构解析和代谢验证串联起来，揭示了一个反直觉的调控逻辑：去甲基化不一定总是激活基因，也可能为抑制因子"打开大门"。结构生物学证据（单个甲基与Gln94的位阻冲突）使机制解释具有原子级说服力。从合成生物学应用角度看，该发现为作物风味改良提供了精准靶点——通过编辑SlSPL-CNR的Q94残基或操控SlAAT1启动子特定CpG位点的甲基化状态，可在不改变整体甲基化格局的前提下定向调控酯类代谢。跨物种保守性进一步提示，这一调控模块可能在水稻、玉米等主粮作物的品质改良中具有通用价值。

参考来源

Zeng Z, Ma Y, He H, Li L, Peng Y. DNA hypomethylation enables the transcriptional repressor SlSPL-CNR to control fruit flavor ester biosynthesis. Nat Commun. PMID: 42386734.

PMID: 42386734