来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
黏细菌是结构多样性天然产物的著名生产者，但其基因编辑工具的匮乏长期制约着天然产物挖掘效率。本研究通过系统性生物信息学分析绘制了240株黏细菌基因组的7751个生物合成基因簇图谱，从中鉴定出源自黏球菌的内源重组酶MxRecET，并将其与转座子相关核酸酶ISDra2协同组合，开发出名为MxDIRECT的多功能基因编辑技术。该技术可在两周内实现高达200 kb大片段无缝删除、双位点串联编辑及单核苷酸替换，并进一步将模式菌株DK1622工程化为"即插即用"异源表达底盘MxPKS，成功驱动4个聚酮合酶基因簇的异源表达并发现多个新聚酮化合物。
研究背景
黏细菌（Myxococcota门）以产生结构复杂、生物活性显著、作用机制特异的次生代谢物而著称。基因组挖掘揭示了大量与已知化合物不匹配的未开发生物合成基因簇（BGC），使这一微生物类群处于微生物天然产物研究前沿。然而，大多数非模式黏细菌因生长缓慢、可培养性有限和遗传顽固性等内在特性而难以研究。将BGC从未经驯化且遗传难操作的细菌移植到遗传可操作的宿主中进行异源表达，是提高产量或激活沉默BGC的优选策略，但黏细菌BGC的策略性异源表达长期受制于高效底盘的缺乏。尽管恶臭假单胞菌、天蓝色链霉菌和Schlegelella brevitalea等菌株曾被零星用作黏细菌BGC的替代宿主，其应用仍受限，可能归因于通路兼容性差。模式黏细菌黄色黏球菌（Myxococcus xanthus）DK1622是开发黏细菌天然产物专用高效底盘的有前景平台——它是黏细菌范式中研究最充分的菌株，具备快速生长等优良生理特性。
研究方法
黏细菌基因组BGC的系统生物信息学分析
使用"datasets download"命令行工具从NCBI RefSeq数据库共检索到240个完全测序的黏细菌基因组。采用antiSMASH 7.0对所有基因组序列进行推定天然产物BGC挖掘。使用默认设置进行注释，并纳入ClusterBlast、Cluster Pfam分析和基于Pfam的基因本体（GO）术语注释等扩展参数。每个菌株的注释BGC进行汇总（补充数据1）。使用GTDB-Tk 1.6.0构建基因组系统发育树，并通过"ggtree"R包可视化，特征值以每个基因组的BGC类别计数表示。使用BiGSCAPE 1.1.0工具构建BGC相似性网络，以MIBiG存储库2.0中的BGC作为参考。分析在默认设置下进行，合并所有类别并保留单例。在0.30–0.70的原始距离截断值下计算序列相似性，步长0.05。PKS类型的结果使用"MetaNet"R包0.2.5在0.65截断值下可视化为序列相似性网络。
菌株、质粒和培养条件
本研究中使用的菌株、质粒和引物分别列于补充表3–5。大肠杆菌菌株在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl，pH 7.0）中培养。黏细菌菌株在CTT培养基（10 g/L酪蛋白胨、1.97 g/L MgSO₄·7H₂O、10 mL/L 1 M Tris-HCl，pH 7.6）或VY/2培养基（5 g/L面包酵母、1 g/L CaCl₂、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O）中于30 °C、200 rpm振荡培养。
MxRecET重组工程的开发
黏细菌内源RecET重组酶的生物信息学分析：以大肠杆菌RecT氨基酸序列为查询序列，对NCBI非冗余（nr）蛋白数据库进行PSI-BLAST搜索。搜索分类学上限定于Myxococcota门，截断标准设为查询覆盖率>60%和序列同一性>30%。
MxRecET重组工程的功能鉴定：编码推定RecET重组酶的DNA序列经商业合成并克隆至pSWU19载体。所得载体随后通过Mx8位点特异性重组整合到黄色黏球菌DK1622基因组串联tRNAAsp基因trnD1内的attB1_Mx8位点。通过电穿孔（1250 V、400 Ω、25 µF）引入一定量（200–1200 ng）含有筛选标记、两侧带有不同长度（20–800 bp）同源臂靶向特定基因组位点（1–200 kb）的线性DNA片段。在1 mL无抗生素CTT液体培养基中恢复一段时间（2–12 h）后，将复苏的细菌悬液涂布于补充60 µg/mL安普霉素的若干CTT平板（15 cm × 15 cm）上进行精确菌落计数。1 mL细菌悬液的总菌落数记为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。为确定精确重组效率，从每次转化中随机选取抗性菌落进行基因型验证。通过PCR筛选和随后的Sanger测序确认靶基因组片段被apraR cassette成功替换。重组效率表示为序列确认阳性克隆的百分比。
通过Cre/loxP重组去除抗生素标记：通过引入表达Cre的质粒pZJY4111，从验证的克隆中切除loxP71-apraR-galK-loxP66标记。通过氯霉素（30 µg/mL）和2-脱氧半乳糖（DOG，10 mg/mL）双重选择分离无标记突变体。最终基因组修饰留下单个34-bp loxP72疤痕，通过PCR和测序验证。最后，通过在无抗生素CTT琼脂上传代5–7天以消除Cre表达质粒，获得最终无标记突变体。
MxDIRECT基因组编辑技术
ISDra2切割质粒的构建：ISDra2切割系统使用带有安普霉素筛选标记的自复制质粒pZJY4111构建。功能cassette包括ISDra2核酸酶基因和231 bp的reRNA，置于香草酸诱导型启动子控制下。对于给定靶位点，将位于TnpB相关基序（TAM）TTGAT下游的20-bp引导序列合成并连接到reRNA支架的3'端。对于双切割策略，将靶向不同位点的两个独立ISDra2–reRNA表达cassette整合到单个pZJY4111质粒中。
修复模板的制备：侧翼靶基因组位点的左右同源臂（100–1000 bp长度）分别从DK1622基因组DNA扩增。左臂和右臂在第二轮重叠PCR中无缝融合以生成全长RT。为保护模板免遭胞内核酸酶降解，使用末端经硫代磷酸酯键修饰的引物对最终产物进行再扩增。
ISDra2切割质粒与修复模板的一步共转化：表达MxRecET重组酶的黄色黏球菌DK1622通过电穿孔共转化含有ISDra2切割质粒和相应线性修复模板的混合物。电穿孔后，细胞立即在无抗生素CTT液体培养基中恢复优化时间，通常为4–8 h。恢复的培养物直接涂布于含0.5 mM香草酸和60 µg/mL安普霉素的CTT琼脂上。生长5–7天后，所有产生的突变体首先通过菌落PCR筛选，随后通过Sanger测序确认。该通用方案适用于单位点无缝缺失或点突变。
双位点缺失的两步转化法：电转感受态细胞用靶向位点1的ISDra2切割质粒和同源修复供体转化，在无抗生素CTT培养基中于30 °C恢复2–4 h，然后通过添加安普霉素（30 μg/mL）和香草酸（0.25 mM）富集培养6–8 h。所得富集培养物随后进行第二次转化，使用靶向位点2的ISDra2切割质粒和同源修复供体。在无抗生素CTT培养基中最终恢复6–8 h后，将培养物涂布于含安普霉素（90–120 μg/mL）和香草酸（0.5 mM）的固体CTT培养基上筛选双敲除突变体，随后通过PCR验证。
底盘细胞MxPKS的构建
丙二酰辅酶A水平的测定：DK1622工程菌株的丙二酰辅酶A含量基本按照先前描述的方法进行。在对数生长期通过10733 × g、4 °C离心10 min收集细胞。细胞沉淀重悬于2 mL冰浴PBS缓冲液中，通过超声破碎细胞。裂解液随后在8000 g、4 °C离心10 min。通过连续稀释丙二酰辅酶A标准品、使用双抗体夹心ELISA试剂盒（Fankew，上海科兴贸易有限公司）进行TMB-HRP比色反应，构建胞内丙二酰辅酶A定量测定的标准曲线。测定450 nm处吸光度，通过线性回归确定浓度（ng/L）。实验样品测得的OD值可通过标准曲线回归方程换算为相应的丙二酰辅酶A浓度。
最小抑菌浓度（MIC）的测定：将菌株培养至对数生长期，初始接种量调至OD600约0.05。然后将菌悬液加入96孔板……
研究结果
黏细菌基因组BGC概览
从NCBI RefSeq数据库下载共240个完整黏细菌基因组，进行离线antiSMASH分析，揭示7751个BGC，归入10个不同类别（补充数据1）。值得注意的是，85.3%的BGC缺乏已知化合物归属，表明黏细菌具有巨大的未开发生物合成潜力（图1a）。对每个菌株各BGC类别进行定量，确定了BGC类别的相对丰度（补充图1）。非核糖体肽合成酶（NRPS）是最丰富的BGC类别，占总BGC的24%，贡献了MyxoDB数据库中已知化合物的11%。核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPP）构成第二大比例，占总BGC的23.2%。矛盾的是，迄今仅鉴定出5种特定化学骨架。聚酮合酶（PKS）可分为四个主要亚型：I型、II型、III型和其他PKS变体。这些BGC占总BGC的一小部分（9.2%），但贡献了已知黏细菌天然产物中不成比例的大份额（18%）。尽管II型PKS在放线菌等革兰氏阳性菌中普遍存在，但在黏细菌中极为罕见。称为pyxidicyclines的芳香族聚酮是黏细菌中唯一一类II型PKS衍生产物。模块化杂合NRPS/PKS生物合成机制约占黏细菌总BGC的20%。然而，这些多功能系统负责了更大的比例——约占所有已知黏细菌天然产物的50%，包括埃博霉素等重磅骨架。综上，未知黏细菌BGC的统计普遍性凸显了开发稳健底盘的迫切需求。
我们在属水平比较了每个基因组的平均BGC数量（图1b）。来自Archangium、Corallococcus和Pyxidicoccus的菌株每个基因组平均携带>42个BGC，支持这些属的重要性，并突显它们是值得优先研究的对象。基于240个完整黏细菌基因组、在科和属水平注释的系统发育树揭示了这些菌株之间的进化关系及其次生代谢物生物合成潜力（图1c）。Polyangiaceae、Archangiaceae和Myxococcaceae科内的BGC高度多样，涵盖几乎所有已知类别，而Anaeromyxobacteraceae科的BGC类型很少。这些结果与Stevens小组的黏细菌泛基因组研究结果一致。RiPP的普遍性值得注意，所检菌株中每个都至少含有一个此类BGC。NRPS、杂合NRPS/PKS和萜烯BGC在不同科和属中广泛分布。糖类BGC在几个属中稀疏分布，可能赋予特定的生态优势（补充图2）。黏细菌领域中BGC的分布依赖于分类学地位，这与Müller小组的工作一致，他们证明了黏细菌天然产物的独特性具有高度属特异性。总之，所描绘的BGC分布图谱为黏细菌基因组挖掘中优先选择有前景的菌株提供了便利。
MxRecET重组工程系统的发现与优化
系统性生物信息学分析揭示的巨大未开发生物合成潜力，强调了开发高效遗传工具包以构建即插即用的DK1622衍生异源表达平台的迫切需求。虽然λ Red等广泛使用的重组工程系统源自噬菌体，但来自大肠杆菌、伯克霍尔德菌和芽孢杆菌的天然重组酶对也已在各自宿主中展现出高效率。我们提出黏细菌可能也拥有可利用的相应内源系统来实现精确基因组编辑。因此，我们以大肠杆菌RecT蛋白的氨基酸序列为探针，在黏细菌基因组中进行同源比对。这一做法在黏细菌中鉴定出8个内源重组酶操纵子，其中4个同时包含recE和recT等位基因（图2a）。理论序列通过商业DNA合成实现，置于中等强度组成型启动子rrnD5的控制下。所得构建体分别使用Mx8整合酶整合到黄色黏球菌DK1622基因组的attB1位点。通过生长速率、质粒转化效率和突变频率评估，RecET重组酶的组成型表达对细胞适应性影响很小（补充图3）。重组工程通过引入两侧带有500 bp同源臂的线性筛选标记（安普霉素抗性基因apraR）进行，靶向携带RecET的DK1622中5 kb的mch BGC（编码myxochromide）。同时，每组24个菌落进行PCR和DNA测序以验证缺失的准确性。以大肠杆菌Rac前噬菌体编码的RecET和噬菌体来源的λ Red（exo-beta）系统作为对照。结果表明，来自编号为Myxococcus sp. MAG-79菌株的RecET操纵子（以下简称MxRecET）在每次转化中实现了最高的菌落形成单位（CFU），并在60 μg/mL安普霉素正选择下提供近100%的编辑准确率（图2b）。
MxDIRECT技术的开发与优化
为突破大片段DNA删除的效率瓶颈，我们将ISDra2（一种源自Deinococcus radiodurans的TnpB核酸酶）的位点特异性切割能力与MxRecET的高效重组工程相结合，开发了MxDIRECT技术（图3a）。质粒干扰实验表明，ISDra2在靶位点引入双链断裂可有效消除转化子，证实其体内切割活性（图3b）。将ISDra2表达质粒、MxRecET系统和200-bp同源修复模板共电转入DK1622后，无缝编辑效率显著提升（图3c）。同源臂长度优化实验显示，随着同源臂从50 bp延长至500 bp，重组效率逐步提高（图3d）。供体质粒与修复模板的质量比优化实验确定了最佳比例（图3e）。
MxDIRECT的多功能编辑能力
MxDIRECT技术支持三种编辑策略（图4a）：单切割策略在靶区域中心引入一个双链断裂，由MxRecET介导同源修复，可删除长达80 kb的DNA片段；双切割策略在靶片段两个边界各引入一个双链断裂，将大小限制提升至200 kb；双位点切割策略可实现串联编辑。单切割策略的尺寸依赖性效率实验显示，随着删除片段从1 kb增至120 kb，正确无缝删除的百分比逐渐下降（图4b）。双切割策略显著提升了大片段删除的效率和尺寸上限，实现了20–200 kb范围内的无缝删除（图4c）。基于两步电穿孔策略的双位点无缝删除优化实验考察了第一次电穿孔后的恢复时间和筛选抗生素终浓度对编辑效率的影响（图4d）。MxDIRECT还支持灵活的单核苷酸基因组编辑——仅需设计靶区域两侧带有TAM基序（TTGAT）的20-nt引导序列和可变修复模板，即可实现精确的碱基替换（图4e）。
底盘细胞MxPKS的构建与验证
利用MxDIRECT技术对DK1622进行了系统性工程改造，包括增强生长性能、消除竞争性通路、改善前体供应和增加稳健性。所得底盘菌株命名为MxPKS。为验证MxPKS的有效性，选择了4个编码5-甲基吡嗪酮（corA）、archangiumides（arc）、支链脂肪酸（bgc34）和蒽醌（vtc）的聚酮合酶BGC进行异源表达（图5a）。HPLC-DAD比较分析（254 nm检测）显示，与DK1622相比，MxPKS表达这些BGC后出现了特征性产物峰（图5b）。化合物1–10的结构通过NMR和ECD计算确定，其中化合物4–6和8–10为先前未描述的新结构（图5c）。
讨论与解读
黏细菌是结构多样的生物活性天然产物的丰富来源，但正如生物信息学分析所揭示的，其庞大的未表征生物合成基因簇储备凸显了加速天然产物发现所需的高效遗传工具的迫切性。先前建立的遗传操作方法，如RecA依赖性同源重组、转座子诱变和替代宿主中的异源表达，受限于效率低、适应性差或周期长，而CRISPR/Cas9系统在黄色黏球菌DK1622中表现出明显的毒性和脱靶效应。本研究开发的内源MxRecET系统可实现高达200 kb的高保真缺失，从根本上克服了效率瓶颈。除实现天然产物发现的异源表达底盘外，这一稳健平台对致力于黏细菌生物学基础研究或多样化生物技术应用的更广泛黏细菌研究群体也具有重要价值。例如，该技术为通过优化对植物病原体的捕食能力将黏细菌工程化为生物防治活体剂，或作为有用酶生物生产的替代底盘铺平了道路。然而，局限性仍然存在：虽然中等强度的rrnD5启动子实现了足够的编辑效率，但组成型重组酶表达可能在这些重复序列丰富的基因组中带来基因组不稳定性风险。
编译者解读
本研究的技术路线体现了合成生物学中"从组学数据到功能工具"的经典范式——先通过大规模基因组挖掘识别需求缺口，再从目标生物自身挖掘内源重组酶，避免了异源系统兼容性问题。MxDIRECT将TnpB的精准切割与RecET的高效重组相结合，在编辑尺寸和操作周期上均优于现有工具，200 kb的无缝删除能力尤为突出。将DK1622工程化为MxPKS底盘的策略也值得借鉴：并非从头设计，而是基于对菌株自身代谢网络的理解进行系统性改造。值得注意的是，该研究以"发现多个新聚酮化合物"作为底盘验证的终点指标，这提示底盘构建的最终评判标准应是天然产物的实际产出能力而非编辑效率本身。未来若能将MxDIRECT推广至其他黏细菌物种，或与自动化克隆流水线整合，将进一步提升黏细菌天然产物的挖掘通量。
参考来源
Zhang WJ, Hu JQ, Li RJ, Sheng DH, Yue XJ. Development of efficient genetic toolkits and heterologous chassis for bioprospecting of myxobacteria. Nat Commun. PMID: 42373632.
PMID: 42373632