来源：Sustain Microbiol | 编译：DNA Lab Space
导读
燃料乙醇发酵需要添加维生素和氮源等营养 supplement，传统补充剂成本高且不可持续。本研究利用光合蓝藻（Synechococcus sp. PCC 7002）的全细胞水解物作为酵母发酵的营养补充剂，在麦秆和云杉水解物中显著提升了乙醇生产效率。溶菌酶处理的高氮蓝藻生物质使麦秆乙醇初始生产速率提高近3倍，为木质纤维素生物燃料提供了一条可持续的替代路径。
研究背景
为减少温室气体排放并以碳中和方式驱动交通运输系统，可持续替代化石燃料的方案不可或缺。生物炼制概念应运而生——将可再生资源加工为生物乙醇等先进燃料及多种可市场化产品。与原油炼制不同，生物炼制依赖将不同类型生物质逐步精炼为分子组分。植物、藻类和蓝藻通过光合作用将太阳能转化为化学能，储存于糖类、纤维素、木质素和油脂等生物分子中。
先进生物燃料基于多种非粮作物，利用木质纤维素原料。然而，酵母对植物材料的发酵通常需要补充维生素和含氮化合物等营养素，以维持酵母代谢活性和生长。传统营养补充剂成本较高，寻找可持续的替代来源成为该领域的关键问题。
研究方法
麦秆发酵底物的制备
麦秆（Triticum aestivum L.）在Inbicon IBUS中试工厂（丹麦Skærbækværket, Skærbæk）进行水热处理。预处理第一步为水浸泡（80°C，5–10 min），随后物料输送至反应器中进行水热处理（195°C蒸汽注射12 min），全程不添加化学品。最终物料干重约为40% w/w，收集于塑料袋中，4°C储存。商业纤维素酶制剂Cellic CTec2（Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark），酶活为120 FPU g⁻¹，按每克干物质22.8 mg的剂量添加至预处理麦秆中，同时加入柠檬酸钠缓冲液（50 mM，pH 4.8）和水。混合物置于100 ml蓝盖瓶中，在轨道摇床（150 rpm）中50°C水解4天（Jørgensen 2009）。所得水解物经离心收获，液体与固体部分分离后4°C储存。
蓝藻生物质的制备
研究假设蓝藻生物质的氮含量对其作为酵母发酵营养补充剂的价值至关重要，因为蓝藻的高氮含量通常与高蛋白质及其他营养素含量相关（Forchhammer and Schwarz 2018）。在氮限制条件下，蓝藻出现缺绿现象，细胞降解蛋白质、色素、核酸及其他细胞组分，C/N比显著升高。为获得不同氮含量和营养组成的蓝藻生物质，Synechococcus分别在氮充足或氮限制条件下培养（图S1），分别产生高氮（N-high）和低氮（N-low）生物质。培养约65 h后收获，此时氮限制培养物已表现出缺绿现象。如预期所料，低氮生物质的叶绿素和藻胆蛋白含量显著低于高氮生物质，而碳水化合物含量则更高（表1）。
生物质在用于发酵试验前，按"材料与方法"所述进行酸水解或酶水解处理（表2）。选择这些处理方式是因为它们在生物质和细菌细胞降解中的应用已较成熟。酸处理为剧烈手段，而溶菌酶处理较为温和，推测比酸处理能更大程度地保留生物分子。
发酵系统设计与验证
为建立一种简单、小体积的乙醇生产测定方法，研究设计并评估了小型发酵瓶的重量损失测量法。在碳水化合物发酵产乙醇过程中，乙醇产量与CO₂产量相关，理想条件下摩尔比为1:1（见"材料与方法"部分）。因此，发酵系统因CO₂气体逸失导致的重量损失可作为乙醇产量的度量指标。
发酵试验
以含葡萄糖（40 g l⁻¹）的培养基作为最优发酵底物，添加不同预处理方式（0.5% w/v）的高氮或低氮蓝藻生物质（表1和表2），进行S. cerevisiae发酵测试。麦秆水解物同样添加不同预处理的蓝藻生物质（0.5% w/v）进行发酵。云杉水解物发酵中，添加高氮、酶解蓝藻生物质（1.5% w/v）或与CBS培养基相同的维生素补充剂，每种发酵条件设置三个生物学重复。CBS培养基中接种和不接种酵母的发酵分别作为酵母存活力的阳性对照和评估水分蒸发的阴性对照。
研究结果
发酵系统的可靠性与验证
在葡萄糖发酵试验中，乙醇产量与发酵瓶重量损失相关（图2A）。基于多次发酵实验（n = 77），由CO₂损失确定的乙醇产量与HPLC分析确定的乙醇产量之间存在明确相关性（图2B）：线性回归斜率为1.132（95%置信区间：1.101至1.163），y截距为−0.222（95%置信区间：−0.765至0.321），决定系数R² = 0.987。结果清楚显示，重量法测定的乙醇产量与HPLC测定结果呈线性相关，证实重量法能可靠估算乙醇产量。
图1展示了小型发酵瓶装置的设计。发酵过程中，葡萄糖被S. cerevisiae代谢为乙醇和CO₂。CO₂穿过细针逸出，导致发酵瓶出现可测量的重量损失，该损失与乙醇产量相关。细针同时限制O₂进入，维持厌氧条件。
蓝藻生物质的组成
表1显示了高氮与低氮蓝藻生物质的组成差异。高氮生物质（n = 2）的碳水化合物含量为16 ± 1%（干细胞质量百分比），叶绿素含量为0.35 ± 0.01任意单位，藻胆蛋白含量为0.28 ± 0.00任意单位。低氮生物质（n = 4）的碳水化合物含量为44 ± 23%，叶绿素含量为0.18 ± 0.02任意单位，藻胆蛋白含量为0.05 ± 0.03任意单位。
表2列出了六种蓝藻生物质补充剂的制备方案：#a为低氮、溶菌酶37°C加50°C处理；#b为低氮、溶菌酶37°C处理；#c为低氮、酸水解100°C处理；#d为高氮、溶菌酶37°C加50°C处理；#e为高氮、溶菌酶37°C处理；#f为高氮、酸水解100°C处理。
葡萄糖发酵
图3A显示了96 h发酵时间过程实验，图3B显示了前24 h内的初始发酵速率。与不添加蓝藻生物质的对照（#g）相比，溶菌酶处理的高氮蓝藻生物质（#d和#e）使发酵速率提高最多，约为3倍。低氮（#a和#b）或酸处理蓝藻生物质（#c和#f）对发酵速率的影响小得多。酸处理的低氮蓝藻生物质（#c）甚至导致发酵速率略有下降，表明酸处理产生了抑制酵母的化合物。这些结果证实蓝藻生物质可作为酵母发酵的补充剂以增强葡萄糖产乙醇，且酶处理在营养 mobilization 方面优于酸处理。
麦秆发酵
麦秆是生物乙醇发酵的典型底物，添加酵母提取物等合成或复合营养素可改善其发酵性能（Jørgensen 2009）。麦秆水解物添加不同预处理的蓝藻生物质（0.5% w/v）后进行S. cerevisiae发酵。图3C提供了96 h发酵时间过程实验。与无补充剂的对照发酵#g相比，除发酵#c（低氮、酸处理）外，所有添加补充剂的发酵初始速率均有所提高，#c的发酵曲线与对照几乎相同。补充#d和#e（高氮、溶菌酶处理）的发酵在48 h后分别达到最大CO₂损失75和77 mg，此后几乎没有增加；而补充#a和#b（低氮、溶菌酶处理）的发酵达到相同水平需要72 h。
云杉水解物发酵
图4显示了云杉水解物的乙醇生产时间过程。添加高氮、酶解蓝藻生物质（1.5% w/v）的发酵（黑色方块、虚线）与添加CBS培养基相同维生素补充剂的发酵（白色圆圈、实线）进行比较。每种发酵条件设置三个生物学重复，图中展示了每个重复的乙醇产量。100%乙醇对应葡萄糖完全化学计量转化为乙醇。未添加营养补充剂时未观察到乙醇生产。
讨论与解读
利用植物生物质和光合微生物生物质等可再生资源，是开发可持续工艺以减少温室气体排放的有前景策略。本研究证明，预处理的全细胞蓝藻生物质能显著增强S. cerevisiae对木质纤维素底物的乙醇发酵。具体而言，溶菌酶处理的高氮蓝藻水解物使麦秆乙醇生产速率提高约3倍，而酸水解生物质仅提高0.5倍。低氮蓝藻生物质无论预处理方式如何，对发酵的影响都微乎其微。云杉水解物的发酵同样受益于蓝藻补充剂，尤其在缩短发酵迟滞期方面。
研究选择蓝藻制备营养补充剂，是因为这些生物的细胞壁容易被溶菌酶水解，从而可采用相对温和的处理方式，保留并 mobilization 多种细胞组分（Möllers et al. 2014）。相比之下，微藻作为真核生物，具有多样且往往顽固的细胞壁结构，使细胞组分的降解和 mobilization 复杂化（Shivakumar et al. 2024）。研究还测试了酸处理——这是生物燃料发酵中常用的生物质 mobilization 方法，但该方法容易降解许多对生长有价值的生物分子。
编译者解读：本研究的方法学亮点在于用重量法替代HPLC进行乙醇定量——简单、廉价、可平行高通量，非常适合营养补充剂筛选。从合成生物学应用角度看，蓝藻作为光合自养生物，可利用光能和CO₂生产含氮营养物，与木质纤维素发酵形成"光能驱动+废物利用"的耦合体系。局限在于蓝藻生物质生产成本尚未评估，且溶菌酶处理的规模化可行性仍需验证。未来若能将蓝藻培养与工业发酵废液中的氮磷回收结合，有望进一步降低补充剂成本。
参考来源
Donati VL, Blossom BM, Cannella D, Frigaard NU. Whole-cell hydrolysate of cyanobacteria enhances biofuel fermentation of plant biomass. Sustainable Microbiology, 2025. PMID: 42576851.
PMID: 42576851