酵母双通道光遗传学：多色光独立控制细胞过程与代谢通路

📅 2026-08-13 📰 Nat Commun 2026 May 22 📂 研究进展 👁 17

来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space

导读

光遗传学利用光线在基因水平控制细胞功能，已在细胞生理研究、生物材料和代谢工程中展现应用价值。酿酒酵母是工业相关模式生物，但受限于基因数量与不同波长光之间的交叉激活问题，多色光遗传学一直未能在该物种中实现。本研究开发出仅需单基因、无需外源辅因子的红光响应光遗传系统y-iLight，并通过模块化蛋白结构域工程降低蓝光交叉激活，最终与EL222蓝光系统整合，在酿酒酵母中建立了真正的双通道光遗传平台。研究团队进一步将该系统应用于黄酮类化合物木犀草素的合成调控、细胞絮凝沉降以及双色活体材料图案打印，展示了多色光动态正交控制细胞过程的广阔潜力。

研究背景

光遗传学是合成生物学中利用光控制细胞过程的新兴领域。与传统化学诱导方法相比，光遗传学避免有害化学物质、对生物系统具有正交性、支持动态控制并具备空间分辨率。研究者已开发出覆盖红光、蓝光、绿光和紫外光等多种波长的光遗传系统，而多色光复用能够在细胞内对不同功能进行独立正交控制。尽管多路光遗传学已在大肠杆菌和哺乳动物神经元中实现，但由于缺乏紧凑的正交光遗传系统以及不同颜色光之间的交叉激活问题，酿酒酵母中仅实现了单通道光遗传学应用。酿酒酵母是遗传背景清晰、生物学特性明确的模式生物，已广泛用于生产高价值化学品、药物、生物燃料、生物材料、环境诊断、替代食品和临床治疗等合成生物学应用。本研究旨在开发适用于酿酒酵母的紧凑型红光光遗传系统，并实现与蓝光系统的双通道整合。

研究方法

将双通道光遗传学应用于生物材料图案化

本研究中涵盖的双通道光遗传学最终应用是利用光遗传学的空间分辨率。利用光模式在特定位置指定细胞中基因激活的能力，在生物材料、神经科学和微生物群落相互作用研究中具有重要用途。展示光遗传学空间特性的常用方法是将图像投射到带有荧光或彩色基因产物的细胞菌苔上，从而将图像"打印"到细胞上。虽然大肠杆菌中已实现多色图像，但酿酒酵母中仅通过单通道光遗传学实现了单色图像。

为实现多色图像，从OY-β.mA1LINX构建了菌株OY-γ.RB（红-蓝）。lacZ酶被指定为蓝光通道的输出，CrtI被指定为红光通道的输出。在蓝光存在下，X-Gal被催化为蓝色染料（5,5'-二溴-4,4'-二氯靛蓝），在红光存在下，CrtI完成橙色β-胡萝卜素的生物合成（图8a和补充图15）。

▲ Cells were deposited on YNB agar by evaporating a layer of cells suspended in water overnight. Plates were exposed to 5% red light for 24 h through a mask, followed by 100% blue light for 24 hours through a mask. a Genetic circuit for OY- γ.RB (Red-Blue). b Imprinting letters spelling ‘I SEE YOU’. c

细胞通过将悬浮在水中的细胞层过夜蒸发沉积在YNB琼脂上。平板通过掩膜暴露于5%红光24小时，随后通过掩膜暴露于100%蓝光24小时。OY-γ.RB在琼脂上生长为薄层细胞，使用Optobox将不同图像投射到表面（补充图16）。图案被切割成黑色纸张并用作滤光器，以红光照射选定区域24小时，蓝光照射24小时。研究发现，在这种情况下，不需要NIR光来消除交叉激活（补充图17）。使用这种方法，研究团队成功印刻了从字母到标志和精细图像的多种多色图案，展示了该系统高空间分辨率及开发复杂活体材料的潜力。

开发酿酒酵母中的单组分红光通道

多种红光响应转录因子已开发用于酿酒酵母、细菌和哺乳动物细胞。然而，它们的缺点包括需要整合多个基因、添加外源辅因子或额外基因用于体内辅因子的内源合成。考虑到双通道系统中包含过多基因可能对细胞造成代谢负担并增加克隆难度，研究团队寻求一种能够利用内源辅因子的功能性单组分红光敏感转录因子。虽然据研究者所知，酿酒酵母中尚未实现此类系统，但iLight系统先前已在大肠杆菌和哺乳动物细胞中开发。iLight是一种单组分远红光转录因子，通过工程改造光敏IsPadC BphP蛋白获得。该蛋白由DNA结合域与IsPadC BphP的进化光敏核心模块（PCM）融合组成，PCM形成同源二聚体阻止DNA结合域的二聚化。暴露于红光（660 nm）时，PCM构象改变允许DNA结合域二聚化，从而结合同源DNA序列。相反，近红外光（770 nm）诱导从激活态向失活态的转变（图1c）。iLight在哺乳动物细胞中不依赖外源辅因子，因为它利用内源产生的胆绿素IXa。因此，研究者推断它在酿酒酵母中同样适用，因为酿酒酵母已知表达天然血红素加氧酶Hmx1，催化胆绿素的产生。

▲ a 双通道光遗传学将能够对生物制造中使用的生物体的代谢流进行多功能控制，并可用于更复杂的工艺和优化。b 光遗传学在活体材料工程中具有潜在应用价值，通过两个光通道，可以控制活体材料上多个基因的局部表达。c 描述我们的y-iLight红光通道机制的示意图。d 描述EL222蓝光通道机制的示意图。

细菌中展示的iLight版本不能直接适应酿酒酵母，因为该蛋白缺乏在真核生物中发挥功能所需的激活域和核定位序列。此外，哺乳动物细胞中展示的版本理想情况下不应使用，因为它利用酿酒酵母Gal4 DNA结合域，因此对酿酒酵母生物学不具有正交性。为工程改造适合酿酒酵母的系统，研究者将iLight哺乳动物变体的Gal4 DNA结合域替换为LexA蛋白。LexA常用于正交合成酿酒酵母转录因子。由于细菌变体利用突变的LexA结构域，研究者推断该蛋白的构象在野生型LexA下应具有类似功能。由于原始SV40 NLS已在N末端与Gal4结构域融合，SV40 NLS被重新附加到C末端，产生命名为y-iLight的合成酿酒酵母转录因子。Y-iLight被克隆到组成型酿酒酵母GAP1启动子下游并整合到酿酒酵母基因组位点YORWd17。同源启动子改编自Stelling等人，由CYC1核心启动子上游的8个串联lexO重复序列阵列组成。为评估不同核心启动子对系统的可能影响，又克隆了两个质粒，将cPCYC1替换为PGK1或ENO1核心启动子。这些启动子分别命名为PlexCYC1、PlexPGK1和PlexENO1，并克隆到低拷贝附加体质粒上的mCitrine荧光报告基因上游，转化到表达y-iLight的酵母中（图2a）。

▲ a Genetic circuit of the iLight protein adapted to S.cerevisiae as a red light optogenetic system. b Expression of mCitrine fluorescent reporter through y-iLight paired with a lexO array upstream of various core promoters in comparison to constitutive P ACT1 . BY474R cells were cultured at 30 °C in

所有3个转化体在光遗传学光盒（Optobox）上以0%、2.5%、10%、25%、50%和100%强度的红光培养（光照强度操作单位见方法）。ACT1启动子在工业和研究应用中常用作酿酒酵母的特征明确启动子。为评估工程启动子能否驱动足够水平的基因表达以应用于实际，将其活性与PACT1进行比较。因此，使用y-iLight启动子被组成型PACT1替换的质粒上游接mCitrine报告基因作为对照，同样在0%、25%、50%和100%红光强度下培养。与保持在黑暗中的细胞相比，所有三种y-iLight响应质粒在暴露于各种强度的红光时均观察到表达增加（图2b）。这表明iLight已成功重构为在酿酒酵母中工作，无需任何额外辅因子。

不同的核心启动子导致不同水平的报告基因表达，值得注意的是，PlexCYC1和PlexPGK1暴露于超过10%的红光强度导致y-iLight活性下降，而PlexENO1在红光强度大于50%时出现类似下降。所有条件下培养物的OD600未显示任何生长缺陷（补充图1a），表明红光未对细胞活力产生负面影响。由于这种非线性行为存在于所有三种核心启动子中，很可能是y-iLight转录因子本身的伪影。红光启动子非线性行为的一种可能解释是活性y-iLight的空间位阻，阻止其他转录因子和转录元件结合，因为转录激活因子在核心启动子附近结合已被证明会因干扰RNA聚合酶结合而降低表达。另一种可能的机制是"促进扩散"，当转录因子在DNA链上拥挤时，虽然初始结合速率增加，但转录因子的停留时间减少，导致启动子表达不佳。两种提出的机制都会表现为高浓度活性转录因子存在下启动子表达降低。三种启动子可能对光具有不同的敏感性，因为核心启动子包含RNA聚合酶结合位点、转录起始位点以及DNA中聚合酶起始转录的区域。

双通道正交性验证与串扰消除

为验证双通道系统的正交性，BY474B菌株（表达EL222蓝光系统）在25%红光、25%蓝光或黑暗条件下培养。结果显示，红光对蓝光通道无激活作用，但蓝光对红光通道存在交叉激活。通过工程改造y-iLight的核输出序列和光敏降解子，研究者开发了y-iLightLINX、y-iLightmA1LINX和y-iLightmA6LEXY等变体，有效降低了蓝光交叉激活（图3）。

▲ a Expression of mTurquoise by BY474B in response to red light compared to blue light and darkness. Strain was cultured at 30 °C in a shaking incubator while exposed to 25% red light, 25% blue light or darkness. Fluorescence was measured at 24 h and normalized to OD 600 . Values are an average of 3 b

在OY-α和OY-β菌株背景中，双通道系统在不同光照组合下表现出良好的独立调控特性。随着蓝光强度从0%增加至100%（伴随50% NIR），mTurquoise表达逐渐升高而mCitrine表达保持低位；反之，红光强度增加时mCitrine表达上升而mTurquoise保持低位。在交替光照循环和同时光照条件下，两个通道均可被独立激活（图4）。

▲ a 在OY-α、OY-β.LINX、OY-β.mA1LINX和OY-β.mA6LEXY中mTurquoise的表达，以及（b）这些菌株中mCitrine的表达，在递增强度的蓝光加近红外（NIR）光下的情况。菌株在30 °C摇床培养箱中培养，暴露于50% NIR和0–100%蓝光下。24 h时测量荧光，并归一化至OD 600。数值为3个生物学重复的平均值。误差棒表示以均值为中心的样本量n = 3的标准差。c 在OY-α、OY-β.LINX、OY-β.mA1LIN

木犀草素生物合成的光控调控

为展示双通道光遗传学在代谢工程中的应用，研究者构建了OY-γ.LutB/R(D)菌株，通过菱形途径将柚皮素酶法转化为木犀草素。蓝光通道控制F3'H表达，红光通道控制FNSI表达。在不同红光/蓝光循环条件下培养24小时后，通过HPLC提取并表征黄酮类化合物。RT-qPCR结果显示，蓝光加NIR光照条件下F3'H表达显著高于红光条件，而FNSI表达模式相反，证实了双通道对两个基因的独立调控（图5）。

▲ a Enzymatic conversion of naringenin to luteolin through a diamond shaped pathway. b Genetic circuit for OY- γ.LutB/R(D). c Flavonoid production of OY- γ.LutB/R(D) in varying cycles of red and blue plus NIR(Near Infrard) light. Strain was cultured at 30 °C in a shaking incubator in cycles with a per

动力学模型模拟

研究者建立了数学模型，模拟不同光照循环下木犀草素的产生动力学。模型预测与实验数据具有良好的一致性，R²值较高，验证了模型对双通道光控代谢通路的预测能力（图6）。

▲ a 暴露于一个循环的不同比例蓝光加近红外光后照射红光时的模拟类黄酮浓度（n = 1）。b 模型示意图，阐明从柚皮素产生木犀草素的两条途径的调控机制和反应动力学。c 在蓝光加近红外光后照射红光、周期为120 min、持续24 h的不同占空比下预测的类黄酮水平（n = 1）。d 在[12] h光照循环下预测的时间响应曲线（n = 1）。e 计算得到的R²（决定系数）值。

生长-生产-提取三相生物制造

为简化产品提取流程，研究者构建了OY-γ.LutFlo菌株，在红光通道控制下表达絮凝基因。在蓝光加NIR光条件下培养24小时后切换至红光6小时，OY-γ.LutFlo菌株形成絮凝物沉降，上清液中OD600显著降低，而木犀草素在上清液（Top Fraction）中的浓度显著高于含絮凝物的培养液（Bottom Fraction），实现了产物的简便分离（图7）。

▲ a Workflow of growth-production-extraction three-phase biomanufacturing. b Genetic circuit of OY- γ.LutFlo. c Photographs of flocculation of OY- γ.LutFlo in various light conditions. Cultures were kept in either darkness for 48 h, 50% NIR(Near-Infrared) light for 48 h, or 24 h of 25% blue plus 50% N

研究结果

红光通道表征结果

与黑暗对照相比，所有三种y-iLight响应质粒在暴露于各种强度红光时均观察到表达增加，证实iLight已成功重构为在酿酒酵母中无需额外辅因子即可工作。不同核心启动子产生不同水平的报告基因表达：PlexCYC1和PlexPGK1在红光强度超过10%时y-iLight活性下降，PlexENO1在红光强度大于50%时出现类似下降。所有条件下OD600未显示生长缺陷，表明红光未对细胞活力产生负面影响。

蓝光通道表征结果

EL222蓝光系统在P6CCL启动子驱动下表达mTurquoise荧光报告基因。BY474B细胞在30°C摇床培养箱中暴露于0%-100%蓝光以及30分钟100%蓝光/30分钟黑暗循环条件下，荧光在24小时时测量并归一化至OD600。结果显示蓝光强度与报告基因表达呈正相关，循环光照条件下表达水平介于持续光照和黑暗之间（图2d）。

双通道正交性验证结果

BY474B菌株在25%红光、25%蓝光或黑暗条件下培养，结果显示红光条件下mTurquoise表达与黑暗对照无显著差异（配对双尾独立t检验），证实红光不激活蓝光通道。然而，蓝光条件下y-iLight驱动的mCitrine表达较黑暗对照有所升高，表明存在蓝光对红光通道的交叉激活。通过引入光诱导核输出序列（LINX）和光敏降解子（mA1、mA6），y-iLight变体在蓝光下的交叉激活显著降低，同时保持红光激活能力。在OY-α和OY-β菌株背景中，随着蓝光强度从0%增加至100%（伴随50% NIR），mTurquoise表达逐渐升高而mCitrine表达保持低位；反之，红光强度增加时mCitrine表达上升而mTurquoise保持低位。在交替光照循环和同时光照条件下，两个通道均可被独立激活（图4）。

木犀草素光控合成结果

OY-γ.LutB/R(D)菌株在不同红光/蓝光循环条件下培养，HPLC分析显示，当蓝光加NIR光占比较高时木犀草素产量较高。RT-qPCR结果显示，蓝光加NIR光照条件下F3'H表达显著高于红光条件，而FNSI表达模式相反。在12小时蓝光加NIR/12小时红光的循环条件下，木犀草素产量在24小时达到峰值。动力学模型预测与实验数据的R²值较高，验证了模型准确性。

三相生物制造结果

OY-γ.LutFlo菌株在蓝光加NIR光条件下培养24小时后切换至红光6小时，形成絮凝物沉降。上清液OD600从约0.8降至约0.2（p = 0.00421），而OY-γ.LutB(D)对照菌株上清液OD600保持高位。木犀草素在Top Fraction中的浓度约为0.35 mg/L，显著高于Bottom Fraction（p = 0.00562），表明絮凝有效促进了产物分离。

多色图案打印结果

OY-γ.RB菌株通过5%红光24小时和100%蓝光24小时掩膜曝光，成功在琼脂平板上印刻了"I SEE YOU"字母、NUS iGEM 2021标志PRYSM以及电影《小行星城》角色Augie Steenback的静帧图像。这些图案呈现红蓝双色，展示了系统的高空间分辨率。

讨论与解读

本研究成功开发了酿酒酵母中首个单组分红光光遗传系统y-iLight，仅需单基因且不依赖外源辅因子，解决了该领域缺乏紧凑型红光系统的瓶颈。与最近开发的PhiReX系统（需表达四个不同基因）相比，y-iLight的26倍诱导倍数介于PhiReX 1.0（11倍）和1.1（41倍）之间，活性与常用天然启动子PACT1相当。通过模块化蛋白结构域工程，研究者有效降低了蓝光对红光通道的交叉激活，实现了真正的双通道正交控制。将双通道系统应用于木薯素合成调控和细胞絮凝，展示了光遗传学在代谢工程和生物分离中的实用价值。多色图案打印进一步证明了该系统在活体材料开发中的潜力。

编译者解读：本研究巧妙利用酿酒酵母内源胆绿素作为辅因子，避免了外源辅因子添加的复杂性，这一设计思路值得借鉴。双通道光遗传系统为代谢通路的动态正交调控提供了新工具，尤其"生长-生产-提取"三相生物制造策略将光控絮凝与产物合成耦合，解决了微生物发酵中产物分离的瓶颈问题。然而，y-iLight在红光强度超过10%时出现的非线性响应提示该系统在高光强条件下的调控精度有限，实际应用中需谨慎选择光照参数。未来若能将更多波长的光遗传系统整合进酵母，将进一步提升多色光正交控制的复杂度与精细度。

参考来源

Tan LYH, Lin Z, Yeoh JW, Zhang J, Poh CL. Dual-channel optogenetics in yeast for multiplexed light-based control of cellular processes and pathways. Nat Commun. PMID: 42173879.

PMID: 42173879

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