来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
DNA甲基化通常被视为基因沉默的标志，而主动去甲基化则与基因激活相关联。本研究颠覆了这一传统认知：在番茄果实成熟过程中，SlDML2介导的去甲基化并非简单地"打开"基因，而是为转录抑制子SlSPL-CNR腾出了结合位点，进而抑制酯类香气物质合成基因SlAAT1的表达。研究通过DAP-seq、结构生物学和CRISPR敲除等多维度手段，揭示了DNA低甲基化促进抑制子招募这一全新的调控逻辑，并证明该机制在水稻、玉米等作物中保守存在。
研究背景
基因组DNA甲基化是保守且被广泛研究的表观遗传修饰，指甲基基团（–CH₃）共价添加至胞嘧啶第五位碳原子（5-mC）。植物中DNA甲基化可发生于所有胞嘧啶序列背景下，包括对称的CG、CHG（H代表非C核苷酸）和非对称的CHH。精确的DNA甲基化调控对X染色体失活、转录控制、基因组印记、转座子沉默及染色体稳定性维持等众多生物学过程至关重要。
近年研究表明，DNA甲基化动态变化对肉质果实的成熟至关重要。在番茄果实成熟过程中，DEMETER-LIKE 2（SlDML2）介导的DNA去甲基化发生在超过20,000个基因组区域，这种DNA甲基化丢失间接促进了主调控因子RIN对部分靶标启动子的结合。然而，成熟诱导的去甲基化是否也能直接改变转录因子（TF）与DNA的识别，此前尚未得到验证。本研究正是围绕这一核心科学问题展开。
研究方法
植物材料与生长条件
本研究使用野生型（WT）番茄品种AC（Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig），以及CRISPR/Cas9敲除突变体（slcnr-1、slcnr-2）和转基因株系（pCNR::gCNR-3xFLAG和pDML2::gDML2-3xFLAG，均以AC为背景）。植物在受控环境生长室中培养，光周期为16小时光照/8小时黑暗，昼温26–28°C，夜温18–20°C，相对湿度65%。CRISPR/Cas9载体构建和植物转化按照已有方案进行。每个发育阶段采集三个独立生物学重复（每个重复6个果实）。本研究所用引物序列见补充数据10。
实时RT-PCR分析
使用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme, RC411）从番茄果实组织中提取总RNA。使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR Kit（Vazyme, R223）按制造商方案合成互补DNA（cDNA）。cDNA稀释5倍后，取2 µL模板用于20 µL qPCR反应体系，含ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme, Q711）。所有反应均设三个生物学重复。
DNA亲和纯化测序（DAP-seq）和ampDAP-seq
DAP-seq按照已建立的方案进行。使用Plant DNAzol Reagent（Invitrogen, 10978021）从成熟WT果实（46 dpa）中提取基因组DNA，经Bioruptor Plus（Diagenode, UCD-300）超声打断至250–600 bp片段。打断后的DNA依次进行末端修复（End-It DNA End Repair Kit, Lucigen, ER0720）、加A尾（Klenow Fragment 3′→5′ exo-, NEB, M0212L）和Y型接头连接（T4 DNA Ligase, Promega, M1804）。对于ampDAP-seq，取15 ng接头连接DNA进行12个PCR循环以消除甲基化。将SlSPL-CNR开放阅读框克隆至pIX-Halo载体，使用TNT SP6偶联小麦胚芽提取系统（Promega, L4130）在37°C下体外表达2小时。使用Magna HaloTag Beads（Promega, G7282）室温纯化Halo标记蛋白1小时；空载体作为模拟对照。蛋白-DNA结合反应体系含150 ng DNA文库，25°C孵育60分钟。结合DNA在95°C洗脱10分钟，使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme, P521）以带索引的Illumina引物扩增。PCR产物经VAHTS DNA Clean Beads（Vazyme, N411）纯化和大小筛选（200–600 bp），然后在Illumina NovaSeq 6000平台（上海植物逆境生物学研究中心基因组核心设施）上测序。
全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）与数据分析
使用Plant DNeasy Mini Kit（QIAGEN, 69106）从不同发育阶段WT植株果实中提取全基因组DNA。提取的基因组DNA提交至中国科学院上海植物逆境生物学研究中心基因组核心设施，进行全基因组亚硫酸盐转化、文库构建和Illumina NovaSeq 6000高通量测序。
原始150 bp双端读段使用fastp（v0.12.4）进行质量控制，去除接头序列并修剪低质量碱基（Phred质量分数< Q15）。随后使用FastQC（v0.11.9）进行质量评估以确认接头完全去除。清洗后的读段使用Bismark（v0.23.0）比对至番茄参考基因组（SL4.0），参数为“-N 1”以允许种子比对时一个核苷酸错配。使用Bismark中的deduplicate_bismark模块去除PCR重复，使用bismark_methylation_extractor模块提取各胞嘧啶背景（CpG、CHG、CHH）的甲基化调用。仅保留至少4个读段覆盖的胞嘧啶用于下游分析。每个胞嘧啶的甲基化水平计算为含胞嘧啶（C）的读段数除以覆盖该位置的总读段数（C+T（胸腺嘧啶））。基因组区域的平均甲基化水平使用公式∑C/∑(C+T)计算。
亚硫酸盐转化效率通过计算叶绿体DNA中胞嘧啶的非转化率来评估，叶绿体DNA缺乏甲基化，因此可作为内部对照。甲基化调用信息转换为BedGraph格式，随后使用UCSC工具的bedGraphToBigwig（v2.8）转换为BigWig文件，用于Integrative Genomics Viewer（IGV）可视化。差异甲基化分析使用R包methylKit进行。WT-Br与WT-green之间的甲基化差异使用calculateDiffMeth函数评估。q值< 0.05的胞嘧啶被视为显著差异甲基化。应用背景特异性甲基化差异阈值（CG ≥ 20%，CHG（H = A、T或C）≥ 10%，CHH ≥ 5%）来分类高甲基化和低甲基化胞嘧啶，统称为差异甲基化胞嘧啶（DMC）。
凝胶迁移实验（EMSA）
EMSA按照已有方案进行。将SlSPL-CNR的ORF及本研究使用的所有SBP结构域序列扩增并克隆至pET-Sumo载体。将这些载体转入大肠杆菌（BL21），在16°C下诱导培养16小时。使用His-tag Purification Resin（BeyoGold, P2221）按说明书纯化蛋白。DNA探针5′端标记Cy5或FAM。标记探针与纯化蛋白在结合缓冲液（18 mM Tris–HCl, 4.5%甘油, 16 mM MgCl₂, 1.6 mM DTT, 35.4 ng/µL BSA）中30°C孵育20分钟。反应混合物在4°C下于0.5× TBE缓冲液中的6%天然聚丙烯酰胺凝胶上电泳，100 V运行1.5小时。凝胶使用FLA-9000扫描仪（Fujifilm, Japan）可视化。
等温滴定量热法（ITC）
ITC分析使用先前验证的实验方案进行。将SlSPL-CNR的ORF及其SBP结构域克隆至pET-Sumo载体。重组蛋白在大肠杆菌（BL21）中表达，并使用His-tag Purification Resin（BeyoGold, P2221）按制造商方案纯化。通过Ulp1切割去除His-Sumo标签，随后进行二次亲和纯化。纯化蛋白对缓冲液（100 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl, pH 8.0, 2 mM β-巯基乙醇）透析，并调整至40–50 µM。DNA寡核苷酸以相同缓冲液重悬至700–900 µM。滴定在20°C下使用MicroCal PEAQ-ITC（Malvern Panalytical, UK）进行，数据使用Origin 7.0软件分析。详细数据见补充数据3。
染色质免疫沉淀（ChIP）测序
ChIP-seq在绿色（30 dpa）和破色（38 dpa）阶段收获的WT和pCNR::gCNR-3xFLAG转基因果实上进行。对于Western blotting分析的Tag株系，0.2 g样品的浓缩蛋白提取物与6× SDS–PAGE上样缓冲液混合，95°C变性10分钟，在10% SDS–PAGE凝胶上分离并转移至硝酸纤维素膜。膜与anti-flag（Sigma-Aldrich, F3165, 1:5000）或anti-Actin（植物特异性）（ABclonal, AC009, 1:10,000）一抗4°C孵育过夜，随后与anti-mouse二抗（ABclonal, #AS003, 1:10,000）孵育。使用Basic ECL电化学发光试剂盒（ShareBio, WB001）检测信号。
染色质免疫沉淀按照已有方案稍作修改进行。果实果皮组织用1%甲醛交联10分钟，室温下用0.2 M甘氨酸淬灭5分钟。约0.（原文此处截断）
研究结果
SlSPL-CNR在体外偏好结合低甲基化基因组区域
DAP-seq可在保留天然5-mC的同时高效鉴定TF体外结合位点，而ampDAP-seq通过PCR扩增几乎去除所有胞嘧啶甲基化。对DAP-seq、ampDAP-seq和DNA甲基化组数据的整合分析可揭示TF在甲基化位点的结合特征。
为表征SlSPL-CNR对基因组DNA结合的甲基化敏感性，作者首先使用从46天开花后（dpa）成熟果实制备的基因组DNA（gDNA）文库进行DAP-seq（称为CNR-DAP），并使用扩增文库进行ampDAP-seq（称为CNR-ampDAP）（图1a）。同时对46 dpa野生型果实进行WGBS，生成全面的DNA甲基化图谱（称为WT-Red）。CNR-DAP和CNR-ampDAP在重复间表现出高重现性，分别检测到103,923和111,371个结合峰（图1a）。与随机区域对照相比，这些峰在基因区域以及转录起始和终止位点周围显著富集（图1b、c）。从头基序分析鉴定出三个核心基序GTACGG、GTACTT和GTACNA（N代表任意核苷酸碱基），其中“GTAC”是CNR-DAP中统计富集最显著的序列，这与SPL家族典型的结合特征一致（图1d）。前期研究报道SlSPL-CNR可结合SlAP2a、SlCRE1-2和SlTCP18的启动子，这些靶标均被CNR-DAP成功捕获（图1e）。
为评估DNA甲基化对SlSPL-CNR结合的影响，作者整合分析了CNR-DAP、CNR-ampDAP和DNA甲基化组数据。在总共213,326个峰中，根据相对信号强度将26,317个分类为DAP增强型、58,741个为稳定型、128,268个为ampDAP增强型（图2a、b）。ampDAP增强型峰的大量存在表明，与CNR-DAP相比，CNR-ampDAP中SlSPL-CNR结合出现大规模增加。考虑到ampDAP文库缺乏mC修饰，作者推测CNR-ampDAP中SlSPL-CNR结合的增益可能源于DNA甲基化的丢失。与此一致，ampDAP增强型峰表现出显著高于稳定峰的甲基化水平（图2c）。进一步量化所有结合区域中CNR-DAP与CNR-ampDAP信号比与甲基化水平的关系，结果显示显著的负相关（r = −0.48），即随着DNA甲基化水平升高，DAP与ampDAP结合信号比降低（图2d）。这些结果表明，ampDAP增强型峰来源于高甲基化区域——这些区域在5-mC去除后才变得可及，说明SlSPL-CNR偏好结合未甲基化DNA。代表性位点的检查证实了这一模式：低甲基化区域在两种测定中均显示TF结合，而高甲基化区域仅在CNR-ampDAP中显示结合（图2e）。
先前研究强调了DNA结合基序内胞嘧啶对甲基化敏感性的潜在影响。鉴于从头注释的SlSPL-CNR核心基序“GTACGG”含有多个胞嘧啶（图1d），作者研究了基序甲基化是否调节结合。观察到ampDAP增强型峰与稳定峰相比，表现出甲基化基序的显著富集（图2f）。对于排名最高的注释基序序列“GTACGG”，通过扫描番茄基因组中的基序匹配位点，评估了每个胞嘧啶位置（1、4、5和6）的甲基化效应，并将位置特异性甲基化与CNR-DAP/CNR-ampDAP信号比相关联。所有四个位置的5-mC掺入均导致结合减少，其中感觉链第4位（5-mC4; r = −0.59）的抑制最为显著（图2g），该残基被确定为甲基化敏感性SlSPL-CNR结合的关键决定因子。
GTAC-box中的胞嘧啶甲基化降低SlSPL-CNR的DNA结合亲和力
为进一步研究5-mC是否以及多大程度上抑制SlSPL-CNR与GTAC-box核心基序的直接结合，作者使用15-bp DNA探针（GTAC-box1）进行了凝胶迁移实验（EMSAs），探针涵盖未甲基化、半甲基化（仅感觉链含5-mC）和全甲基化（两条链均含5-mC）的“GTAC”基序序列（图3a）。EMSA结果表明，全长SlSPL-CNR及其SBP结构域（氨基酸46–136）均能有效结合未甲基化DNA探针，但无法结合GTAC-box处半甲基化或全甲基化胞嘧啶的探针（图3b）。这些结果证明GTAC-box中的5-mC可降低SlSPL-CNR的DNA结合亲和力。
结构分析揭示SlSPL-CNR甲基化敏感性的分子机制
为阐明5-mC排斥SlSPL-CNR结合的分子机制，作者解析了SlSPL-CNR SBP结构域（氨基酸46–136）与含GTAC-box部分序列的DNA片段的复合物晶体结构（图4a、b）。整体结构显示，SlSPL-CNR的SBP结构域通过带正电的DNA结合界面捕获GTAC-box1P（图4c）。相互作用分析揭示了SBP结构域与DNA磷酸骨架及碱基的详细识别模式（图4d–m）。
关键发现是：将C7建模为甲基化胞嘧啶后，引入的甲基基团会与Gln94产生空间冲突（图4n），这为SlSPL-CNR蛋白偏好未甲基化DNA提供了结构解释。
体内验证SlSPL-CNR的甲基化敏感结合
RT-qPCR分析显示SlSPL-CNR在番茄各组织（根、茎、叶、花）及不同发育阶段果实（17、25、34、38、42、45 dpa）中的相对转录水平（图5a）。CNR-BrChIP峰与CNR-DAP峰的重叠百分比随基序得分提高而增加（图5b）。热图显示CNR-BrChIP、CNR-DAP、染色质可及性（DHS）和组蛋白修饰（H3K4me3、H3K27ac）在ChIP独有、ChIP-DAP共有和DAP独有峰区域的结合信号富集情况（图5c）。精确率-召回率曲线表明，位于DHS区域内的CNR-DAP峰比单独使用CNR-DAP峰能更准确地预测CNR-BrChIP峰（图5d）。AUPRC值证实了这一结论（图5e）。IGV快照显示共有峰与增加的DHS、H3K4me3和H3K27ac信号相关，而DAP独有峰缺乏这些染色质特征（图5f）。
SlSPL-CNR通过甲基化敏感结合抑制SlAAT1表达并调控酯类代谢
在3414个高置信度CNR-BrChIP峰中鉴定出3080个5′-GTACGG-3′位点。根据破色期（Br）与绿色期之间C₄位甲基化变化，将位点分类为稳定-C₄（|Δmeth| ≤ 0.10, n = 2662）、高-C₄（Δmeth ≥ 0.20, n = 57）和低-C₄（Δmeth ≤ –0.20, n = 190）（图6a）。基因集富集分析（GSEA）显示富集分数（ES）为0.35，表明低-C₄位点（n = 190）在Br期CNR结合更强的区域中显著富集，前缘子集（size = 68）是富集的主要贡献者（P = 1.20E-04，双侧置换检验，10,000次置换）（图6b）。
SlAAT1在17、25、34（Br期）和42 dpa果实中的转录本丰度（FPKM）如图6c所示。IGV轨迹显示SlSPL-CNR ChIP-seq结合及SlAAT1启动子处的DNA甲基化，下方为GTAC基序及其对应甲基化水平的放大视图（图6d）。EMSA分析使用65-bp未甲基化（ProAAT1-GTAC）或半甲基化（meProAAT1-GTAC；反义链含两个5-mC）FAM标记探针，全长SlSPL-CNR与1 µM探针孵育，通过250倍或500倍过量未标记竞争探针确认结合特异性（图6e）。双荧光素酶实验表明SlSPL-CNR抑制SlAAT1启动子活性，ProAAT1（1586 bp）代表SlAAT1启动子的1586-bp片段（图6f）。RT-qPCR分析显示Br期WT与slcnr-1/2突变体果实中SlAAT1相对转录水平（图6g）。slcnr-2果实中五种差异酯类代谢物的总相对含量（图6h），以及两种酯类代谢物（氨基甲酸甲酯和丙酸2-甲基-1-甲基乙基酯）在slcnr-2突变体中相对于WT果实的相对含量（图6i）。
甲基化敏感结合在SPL家族中保守存在
系统发育树分析了番茄（16个SPLs）、水稻（3个SPLs）、玉米（3个SPLs）和拟南芥（16个SPLs）的SPL家族成员，使用MEGA12邻接法构建（1000次自举重复），SBP结构域蛋白序列保守性使用ESPript 3.0分析，保守残基（Q94、Q95）以红点标示（图7a）。对番茄、水稻和玉米中选定的SPL转录因子进行了功能注释（图7b）。EMSA实验证明来自三个水稻和三个玉米SBP蛋白的SBP结构域对未甲基化、半甲基化（hm）和全甲基化（fm）GTAC探针（GTAC-box1）表现出甲基化敏感结合，His标签蛋白作为阴性对照（图7c）。
讨论与解读
DNA甲基化在发育过程中及环境响应下持续重写，但转录因子如何感知这些表观遗传变化此前仍不清楚。本研究证明番茄SPL蛋白SlSPL-CNR被其核心基序GTACGG内的5-mC直接排斥。单个甲基基团足以与SBP结构域中的Gln94产生空间冲突，在体外消除结合并减少体内占据。这确立了SlSPL-CNR作为甲基化敏感抑制子的地位，并提供了植物特异性SPL转录因子甲基化依赖性调控的首个实验证据。该传感器残基（Gln94/95）在被子植物SPL中不变，水稻（如OsSPL14）和玉米（如ZmSPL15）的直系同源物表现出相同的甲基化诱导结合丧失，表明整个农业重要家族都具备读取DNA甲基化状态的能力。
先前研究确立了Cnr表观等位基因——以SlSPL-CNR启动子内高甲基化为特征——作为表观遗传调控番茄果实成熟的典型范例。有趣的是，SlSPL-CNR功能缺失突变并不能完全重现Cnr表观等位基因特有的严重成熟缺陷，暗示SlSPL-CNR缺失单独不足以解释Cnr表型的完整分子病因。本研究的发现揭示了甲基化敏感性在SPL家族中的保守性，为理解表观遗传信息如何通过转录因子解码提供了新的框架。
编译者解读
这项研究的价值在于颠覆了"去甲基化=激活"的简化认知，展示了表观遗传调控的"阴与阳"——同一去甲基化事件既可为激活子开路，也可为抑制子让道。从合成生物学应用角度看，SlSPL-CNR的甲基化敏感结合机制为作物风味改良提供了精准靶点：通过CRISPR敲除该抑制子即可显著提升酯类香气物质积累，而无需繁琐的代谢通路工程。结构解析出的Gln94关键残基也为设计甲基化不敏感或超敏感的合成转录因子提供了理性设计蓝图。值得关注的是，该机制在主要作物中保守，意味着这一调控逻辑可望推广至水稻、玉米等作物的品质改良。
PMID: 42386734