来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
异黄酮是一类具有独特C6-C3-C6骨架的植物次生代谢产物，在药理和生理层面均有重要意义。豆科植物中的异黄酮合成途径已被充分解析，但其他植物科中的合成机制长期成谜。近期发表于《自然·通讯》的一项研究，首次在鸢尾科植物中揭示了一条完整的异黄酮生物合成途径——其中包含一个未曾表征的CYP736D家族异黄酮合酶、一个非细胞色素P450类型的（异）黄酮6-羟化酶、两个依赖阳离子的I型O-甲基转移酶，以及一个新鉴定的CYP75F异黄酮3'-羟化酶。进化分析表明，鸢尾科保留了一条古老且保守的异黄酮合成途径，可能代表了陆生植物中的原型路线；而大豆则采用了一条豆科特有的专化途径。该发现填补了鸢尾科异黄酮生物合成的长期空白，也为理解鸢尾科与豆科各自独立的进化轨迹提供了线索。
研究背景
异黄酮是植物界中一类结构特殊的次生代谢物，其标志性的C6-C3-C6骨架由两个苯环通过一个三碳桥连接而成。这类化合物在医药领域备受关注——大豆异黄酮的雌激素样活性、抗氧化能力以及对多种慢性疾病的潜在干预作用，使其成为天然产物研究的热点分子。然而，异黄酮在植物体内的合成路径，长期以来几乎只在豆科植物中被详尽解析。
在豆科植物中，异黄酮合酶（IFS）属于CYP93C家族，催化黄烷酮B环从C2位迁移至C3位，从而形成异黄酮的基本骨架。禾本科植物中则存在CYP71F家族的IFS。这些发现让许多研究者默认异黄酮合成是豆科（或少数禾本科）的"专利"。但事实并非如此——鸢尾科的射干、鸢尾等植物同样富含异黄酮类成分，其合成机制却一直未被阐明。
本研究从射干（Belamcanda chinensis）入手，试图回答一个看似简单却长期悬而未决的问题：鸢尾科植物究竟如何合成异黄酮？答案出乎意料——它们使用的酶和反应顺序，与豆科植物截然不同。
研究方法
植物材料与试剂
射干及其他鸢尾科植物样本采集自中国药科大学药用植物园（南京，31°53′N，118°54′E）。基因组DNA使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取，总RNA则通过天根RNAsimple总RNA试剂盒分离。cDNA文库构建采用Vazyme公司的HiScript III第一链cDNA合成试剂盒。用于提取和生化分析的所有溶剂均为HPLC/MS级。酶促反应和微生物培养中使用的化合物与抗生素购自Herbest（宝鸡，陕西）和Sigma-Aldrich（上海）。酶与分子生物学试剂盒分别来自Vazyme、TransGen Biotech（北京）和Beyotime（上海）。
粗蛋白制备与酶活测定
射干的根茎和根部分别用于粗蛋白提取。组织在液氮中研磨成细粉，以5:1（v/m）的缓冲液与组织比例，用100 mM PBS（pH 8.0）匀浆。匀浆液在4 °C搅拌4小时，随后3580 × g离心10分钟去除碎片。所得上清液再经25,000 × g、4 °C离心2小时。沉淀用冰浴PBS重悬用于后续分析。蛋白浓度通过Beyotime BCA蛋白定量试剂盒测定。
酶活测定在200 μL反应体系中进行，包含测定缓冲液（50 mM磷酸钾，200 mM NaCl，pH 7.5）、50 μg粗蛋白、2 mM NADPH、1 mM DTT，以及100 μM不同底物（如柚皮素、芹菜素或金雀异黄酮）。反应在25 °C孵育12小时后终止。原文摘要未详述反应终止方式及产物提取的具体操作。
候选基因筛选与克隆
研究团队首先对射干的基因组和转录组数据进行了系统搜索，试图寻找已知的IFS同源基因。结果令人意外——在豆科和禾本科中分别编码IFS的CYP93C和CYP71F家族，在射干中均未找到同源序列。考虑到异黄酮类化合物主要积累于射干的根和根茎中，且所有已知IFS均属于CYP71 clan，研究者将注意力集中在地下组织中高表达的CYP71家族成员上。初步筛选获得13个CYP71候选基因，其中11个成功克隆至真核表达载体。
异源表达与体外功能验证
候选基因在真核系统中进行异源表达，随后通过体外酶活实验逐一验证功能。结果显示，仅有一个候选基因（Bch12G003021）能够将柚皮素转化为金雀异黄酮。该活性进一步通过从大肠杆菌中纯化的重组Bch12G003021蛋白得到确认，产物身份经高分辨率质谱（HR-MS）验证。底物谱分析表明，Bch12G003021还能接受橙皮素、甘草素和圣草酚作为底物，但对6-羟基化黄酮类化合物卡他明（carthamidin）无活性。
研究结果
一个全新的IFS：CYP736D家族
Bch12G003021的鉴定本身就是一个意外。它不属于此前已知的任何IFS家族，而是被归入CYP736D家族——一个此前功能完全未知的细胞色素P450家族。这是CYP736D家族成员首次被赋予明确的生化功能。
底物偏好性揭示了一个关键线索：Bch12G003021不能接受6-羟基化的卡他明作为底物。这意味着鸢尾科植物中异黄酮骨架的形成发生在羟基化之前——先构建异黄酮基本骨架，再进行后续的羟基化修饰。这与豆科植物中先羟基化后构建骨架的顺序恰好相反，暗示两条途径采用了完全不同的反应逻辑。
非P450的（异）黄酮6-羟化酶
在异黄酮骨架形成之后，鸢尾科植物还需要在6位引入羟基。这一反应在豆科植物中由P450酶催化，但鸢尾科采用的却是一个非P450类型的（异）黄酮6-羟化酶。原文摘要未详述该酶的催化机制和具体动力学参数。
两个依赖阳离子的I型O-甲基转移酶
途径中还包括两个依赖阳离子的I型O-甲基转移酶。这类酶在植物次生代谢中常见，通常催化羟基的甲基化修饰。鸢尾科异黄酮的典型结构特征——如鸢尾苷元（tectorigenin）等——正是通过甲基化等修饰形成的。两个甲基转移酶的具体底物特异性和催化顺序，原文摘要未提供详细信息。
新鉴定的CYP75F异黄酮3'-羟化酶
途径的末端修饰涉及一个此前未被鉴定的CYP75F家族成员，负责异黄酮B环3'位的羟基化。CYP75F家族在植物中的功能此前同样未知，本研究为其赋予了明确的生化角色。
进化分析：古老而保守的原始途径
进化分析的结果颇具深意。鸢尾科保留的这条异黄酮合成途径，在进化上古老且保守，可能代表了陆生植物中异黄酮合成的原型路线。换言之，鸢尾科使用的可能是"原始版本"的合成方案，而大豆则演化出了一条豆科特有的专化途径。两条途径在酶学工具和反应顺序上均不相同，说明异黄酮合成机制在鸢尾科和豆科中经历了独立的进化轨迹。
这一发现也解释了为什么在射干基因组中找不到豆科或禾本科的IFS同源基因——鸢尾科压根不使用那些"已知"的酶。它们走的是另一条路，一条更古老的路。
讨论与展望
这项研究的价值不止于填补鸢尾科的知识空白。它提出了一个更具普遍性的问题：异黄酮合成究竟在陆生植物中演化了多少次？如果鸢尾科保留的是"原型路线"，那么其他非豆科植物中是否也隐藏着类似的古老途径？现有知识体系以豆科为中心构建的异黄酮合成图景，可能需要被重新审视。
从应用角度看，CYP736D家族IFS的发现为异黄酮的异源生产提供了新的酶学工具。不同底物谱意味着新的合成可能性——例如，利用该酶生产特定结构的异黄酮分子。当然，这些潜在应用尚需进一步的工程化验证。
一个值得注意的细节是：射干的IFS不能接受6-羟基化底物，而豆科植物的IFS可以。这种底物谱差异不仅是酶学特征的差别，更反映了两条途径在反应顺序上的根本不同。这种"殊途同归"的进化策略，在植物次生代谢的演化研究中提供了一个难得的案例。
参考来源
Zhao Y, Shi X, Zhang X, Amy Lyu MJ, Tian M. Discovery of an isoflavone biosynthetic pathway in Iridaceae plants. Nature Communications. PMID: 42362562.
PMID: 42362562