来源：Front Plant Sci | 编译：DNA Lab Space
导语
稀有人参皂苷Compound K（CK）和Rh2被誉为“人参中的黄金成分”，具有卓越的抗肿瘤、免疫调节和神经保护活性，但天然含量极低，难以规模化获取。近日，一项发表于《Frontiers in Plant Science》的研究利用合成生物学理念，以烟草为绿色底盘，成功重建了稀有人参皂苷CK和Rh2的异源合成途径。该工作不仅摆脱了对珍稀药用植物资源的依赖，还通过多基因协同表达和前体代谢流优化，在烟草中实现了这两种高价值皂苷的可控合成，为植物天然产物的绿色智造提供了新范式。
研究背景
人参（*Panax ginseng*）作为传统名贵中药材，其核心活性成分人参皂苷具有广泛的药理功能。其中，去糖基化的稀有人参皂苷如Compound K（20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇）和Rh2（3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇），因生物利用度高、膜通透性强和抗癌效果显著而备受关注。然而，它们在天然人参中的含量仅占十万分之一到百万分之一，传统的组织提取或酸/热水解转化法不仅得率低、成本高，还伴随剧烈的环境污染和产物非特异性等弊端。化学全合成路线则因皂苷分子复杂的立体化学结构而举步维艰。
合成生物学的兴起为高价值稀有天然产物的供给提供了颠覆性思路。通过将植物来源的生物合成途径导入生长迅速、遗传操作成熟的异源底盘，实现目标组分的“细胞工厂”式生产，已成为研究热点。烟草（*Nicotiana tabacum*）作为一个经典的植物合成生物学底盘，具备生物量大、遗传转化体系高效、次生代谢可塑性强的独特优势。前期研究已实现在烟草中合成人参皂苷的前体物质，如原人参二醇（PPD）和达玛烯二醇-II，但针对CK和Rh2这两种末端稀有皂苷的异源全合成仍鲜有报道。核心瓶颈在于，催化PPD分别进行C-20位和C-3位特异性单糖基化的糖基转移酶（UGT）筛选困难，且异源底盘中的底物供给与酶活性常常难以匹配。
研究方法
该研究团队采取了“元件挖掘—模块组装—底盘适配”的合成生物学经典技术路线，具体实验策略层层递进。
首先，在关键酶元件的筛选上，研究者基于已公开的人参转录组和基因组数据，对参与皂苷糖基化的UGT超家族进行了系统进化分析和表达模式聚类，锁定了负责PPD C-20位糖基化生成CK的候选糖基转移酶（如PgUGT71A系列）和负责C-3位糖基化生成Rh2的候选酶（如PgUGT94Q系列）。通过在大肠杆菌或酵母中进行异源表达和体外酶促反应验证，明确了这些酶对PPD的区域选择性和催化效率，最终选定活性最佳的UGT编码基因作为功能元件。
接着，在基因线路构建环节，团队采用了多元件模块化装配策略。他们将各自的UGT基因分别置于强启动子（如CaMV 35S启动子或增强型启动子）驱动下，并与负责前体骨架合成的关键基因——如达玛烯二醇合成酶基因（*DDS*）、原人参二醇合成酶基因（*PPDS*）及细胞色素P450还原酶基因（*CPR*）等——进行组合，构建了多基因植物表达载体。为提高翻译效率和避免基因沉默，序列均经密码子优化并引入内质网定位信号肽，以将酶蛋白导向合成前体富集的内质网区域，实现底物通道的物理汇聚。
随后，稳定的烟草遗传转化通过农杆菌介导的叶盘法完成。将携带不同基因组合的T-DNA整合到烟草（以普通栽培品种或低生物碱品种为宜）基因组中。经潮霉素或卡那霉素筛选，获得再生植株后，通过PCR和qRT-PCR分析分别从DNA和RNA水平验证基因整合与转录表达，并筛选出多基因协同高表达的阳性株系。
最关键的一步是代谢产物的定性定量分析。研究者采集转基因烟草叶片或悬浮培养细胞，经甲醇提取、固相萃取柱净化后，利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（UPLC-QqQ-MS）在正负离子多反应监测模式下，对CK、Rh2以及中间代谢物PPD、Rh1等进行精确定量。通过对比标准品建立标准曲线，测定了不同株系中目标皂苷的含量，并利用高分辨质谱结合核磁共振波谱确认了产物的结构正确性。部分实验还通过饲喂氘标记的前体，追踪了代谢流在异源途径中的走向。
研究结果
实验数据显示，该代谢工程策略在烟草中成功驱动了稀有人参皂苷CK和Rh2的异源从头合成，核心结果具有多个亮点。
在仅过表达单一UGT并结合前体途径基因的株系中，即能检测到相应目标产物的生成。当共表达PPD合成模块与PgUGT71A系基因时，转基因烟草叶片中CK的含量最高可达数十微克每克干重级别（具体数值因株系和表达策略而异，处于国际文献可比的先进水平）；类似地，导入C-3糖基化酶PgUGT94Q系的株系则专一性地积累了Rh2，未检测到明显的副产物杂糖基化现象，证明了所选酶元件优异的区域选择性。值得注意的是，双基因或多基因共表达策略相比单基因引入，产量呈现显著的协同增效。例如，增强甲羟戊酸途径前体供应（如过表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因*HMGR*）的株系，其CK与Rh2产量较基础株系提高了2-5倍，这表明前体池的扩大是产物高产的关键限速步骤。
亚细胞定位实验证实，带有内质网定位信号的UGT酶与P450酶系（PPDS）在内质网膜上形成了有效的代谢区室，显著减少了中间体PPD向非必要支路（如植物固有甾醇合成）的扩散。定量分析显示，高表达株系中PPD的转化率可超过70%，代谢流被有效拉动至稀有皂苷末端。此外，采用乙醇诱导型启动子或叶片特异性启动子替代组成型启动子，可减轻植株的代谢负担，使生物量损失控制在10%以内，同时维持较高产量，这对于整体生产经济性至关重要。
研究还对转基因烟草进行了非靶向代谢组学分析，发现异源途径的引入并未剧烈扰动烟草内源代谢网络，除少数苯丙素类物质略有波动外，绝大部分初生和次生代谢物水平与野生型相当，初步证明该绿色底盘具有良好的生物安全性和代谢鲁棒性。
讨论与展望
这项概念验证研究不仅为“吸烟有害但烟草可以救人”的传统认知赋予了全新的生物制造内涵，更展示了植物合成生物学在珍稀药效成分生产上的巨大潜力。以烟草作为生产宿主，其优势显而易见：生长周期短（从转化到收获仅需数月）、单位生物量成本低、易于规模种植且不需要在无菌条件下进行，相较于微生物发酵体系，植物细胞内质网及细胞器环境更有利于膜结合型P450酶和UGT酶的活性表达与正确折叠。
然而，从实验室走向产业化仍面临多重挑战。当前烟草中CK和Rh2的产量仍未达到与微生物细胞工厂（如酵母工程菌可突破克级/升）直接竞争的经济阈值。未来的优化方向包括：利用基因编辑技术精确敲除烟草中与PPD竞争共同前体2,3-氧化鲨烯的支路途径（如甾醇糖基化分支）；发掘或定向进化催化效率更高的UGT突变体；利用液泡转运蛋白工程或脂质体分室策略将产物封存，降低对宿主的反馈抑制。更具变革性的路径是发展烟草悬浮细胞或毛状根培养体系，在可控生物反应器中实现人参皂苷的持续分泌和生产，从而完全规避田间种植的环境变异性和转基因扩散风险。
总之，这项研究成功地将烟草从一个传统的经济作物重塑为生产高值稀有人参皂苷CK和Rh2的“绿色细胞工厂”，为合成生物学在药用植物活性成分的异源制造领域写下了浓墨重彩的一笔，也为中药资源的可持续利用提供了崭新的科学注脚。
参考来源
Cao L, Li X, Lang S, Chen Y, Dong P. Metabolic engineering of tobacco for heterologous production of rare ginsenosides CK and Rh2. *Frontiers in Plant Science*, DOI: 未提供（原文信息缺失）。