来源：Adv Sci (Weinh) | 编译：DNA Lab Space
肝素作为临床使用最广泛的抗凝药物，其传统动物源生产工艺长期面临安全性与规模化供给的双重压力。合成生物学路线被视为替代方案，但起始步骤双功能酶N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶（NDST）在细菌中的活性表达始终是难以逾越的关卡。近期发表于《Advanced Science》的一项研究，通过挖掘原核来源的多种多糖N-脱乙酰酶，设计并工程化改造了一款人工双功能酶——NDDr-MEc/ST，其催化效率较亲本提升7.48倍，并实现了磺化度达82.8%的N-磺化类肝素多糖合成。这项工作为肝素的人工生物合成提供了新的酶学工具。
研究背景
肝素是一种由糖醛酸和葡糖胺残基组成的硫酸化多糖，其抗凝活性依赖于特定的磺化修饰模式。当前工业肝素主要从猪小肠黏膜中提取，这一来源不仅面临动物源病原体污染风险，还受限于供应链波动。利用微生物细胞工厂从头合成肝素或其前体，已成为合成生物学领域的研究热点。
肝素生物合成的第一步是N-脱乙酰化——将N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）残基上的乙酰基去除，随后由N-磺基转移酶（NST）催化磺基转移反应。在天然途径中，这一连续反应由双功能酶NDST完成。然而，真核来源的NDST在细菌宿主中难以实现可溶性活性表达，这构成了整个生物合成路径的核心瓶颈。寻找或设计能够在原核系统中发挥功能的替代酶，是该领域亟待解决的关键问题。
研究方法
候选酶的挖掘与筛选
研究团队首先从两个方向拓展候选酶库。其一，选取三种已知的类肝素特异性N-脱乙酰酶：ND Pv、ND Dr和ND Hs。其二，基于UniProt和CAZy数据库，系统搜索作用于乙酰化多糖的酶，重点关注碳水化合物酯酶家族4（CE4家族）成员。筛选获得四种CE4家族酶——ND Sp、ND Mr、ND Ar和ND Sl，以及一种CE18家族成员ND Af。系统发育分析显示，类肝素特异性NDases与CE18家族的ND Af亲缘关系更近，而与CE4家族酶距离较远。
表达载体构建
密码子优化的NDase基因由GENEWIZ公司合成，克隆至pET32a(+)质粒的多克隆位点。麦芽糖结合蛋白（MBP）基因以E. coli MG1655基因组为模板，通过引物对MBP-F/MBP-R扩增，经G4S连接肽融合至真核来源NDase的N端。NST基因来自已发表文献，通过刚性连接肽（EAAAK）融合至活性NDase的C端，构建人工双功能酶。以含有NDDr-RL-ST编码基因的pET32a-NDDr-RL-ST质粒为模板，通过PCR构建工程化酶变体。
蛋白表达与纯化
重组质粒先在E. coli JM109中构建，随后转入E. coli Rosetta (DE3)进行蛋白表达。LB培养基（10 g·L⁻¹胰蛋白胨、5 g·L⁻¹酵母提取物、10 g·L⁻¹ NaCl）用于质粒扩增和细胞接种，添加氨苄青霉素（100 µg·mL⁻¹）和氯霉素（50 µg·mL⁻¹）作为选择压力。重组菌株在LB培养基中37°C预培养10小时，然后转接至TB培养基（12 g·L⁻¹胰蛋白胨、24 g·L⁻¹酵母提取物、5 g·L⁻¹甘油、2.54 g·L⁻¹ K₂HPO₄、2.31 g·L⁻¹ KH₂PO₄）进行表达。原文摘要未详述诱导条件、纯化介质及缓冲液组成。
酶工程改造策略
研究团队采用组合策略对先导双功能酶NDDr-RL-ST进行改造。该策略整合了四种计算方法：动态互相关分析（dynamic cross-correlation analysis）、序列一致性分析（sequence consensus analysis）、突变效应预测（mutation-effect prediction），并结合顺序连接肽优化与理性突变设计。原文摘要未详述具体突变位点、连接肽序列变体及高通量筛选方法。
研究结果
原核宿主中N-脱乙酰酶的活性筛选
研究首先在E. coli中表达并表征了多种候选N-脱乙酰酶。结果显示，多种NDase对类肝素（heparosan）的脱乙酰化具有活性。这一发现本身即具有突破意义——此前类肝素特异性NDases尚未在原核宿主中实现功能性表达。值得注意的是，来自CE4家族和CE18家族的酶也被证实能够催化类肝素的脱乙酰化，这拓展了可用于肝素生物合成的酶资源库。原文摘要未提供各候选酶的具体比活力或动力学参数。
人工双功能酶的设计与工程化
将筛选获得的活性NDase与异源NST结构域融合，成功构建了人工双功能酶NDDr-RL-ST。在此基础上，通过动态互相关分析、序列一致性分析和突变效应预测的组合策略，结合连接肽顺序优化与理性突变，获得了变体NDDr-MEc/ST。该变体的催化效率较亲本酶提升了7.48倍。这一提升幅度并非来自单一突变，而是多轮工程化迭代的累积效应。
机制层面的分析揭示了性能提升的分子基础。工程化改造增强了底物结合能力，稳定了活性位点构象，并改善了结构域间的协同性。尤其值得关注的是，N-磺基转移酶与NDDr结构域的相互作用被证实对维持双功能酶催化构象至关重要——这一发现直接指向双功能酶活性依赖结构域间精密协作的机制本质。原文摘要未提供底物结合亲和力（K_m）或转换数（k_cat）的具体数值。
N-磺化类肝素的酶法合成
在功能验证环节，NDDr-MEc/ST展现出将类肝素高效转化为N-磺化多糖的能力，最终产物的磺化度达到82.8%。这一数值意味着绝大多数GlcNAc残基已完成脱乙酰化并接受磺基转移修饰，表明人工双功能酶的催化效率与底物通道化达到了较高水平。原文摘要未提供反应时间、酶用量、底物浓度及磺基供体（如PAPS）的添加量。
讨论与展望
这项研究的核心贡献在于首次在细菌中实现了类肝素N-脱乙酰化与N-磺化的人工酶催化体系。7.48倍催化效率的提升与82.8%的磺化度，共同指向一个可行的酶法合成路径。但更值得深思的是其方法学价值——动态互相关分析、序列一致性与突变效应预测的组合应用，为人工多结构域酶的设计提供了可复用的理性改造框架。
研究同时揭示了双功能酶催化构象的结构基础：NST结构域与NDDr结构域的物理相互作用并非简单的柔性连接，而是参与稳定催化活性构象的功能性接触。这一机制洞见提示，未来人工双功能酶的设计需超越"拼接两个活性结构域"的朴素思路，转而关注结构域间的动态协调。
当然，该体系距离工业应用尚有距离。原文未提供酶的比活力、热稳定性、底物特异性等关键参数，也未涉及PAPS再生或全细胞催化等放大策略。后续研究若能在这些维度取得突破，将推动肝素生物合成从概念验证走向实际生产。这项工作的另一层启示在于：天然酶资源的跨界挖掘——以乙酰化多糖为底物的CE4/CE18家族酶——可能为其他多糖修饰反应提供意想不到的催化剂来源。
参考来源
Xi X, Xu R, Wang D, Yin G, Wang X. Design and Engineering of an Artificial Bifunctional N-Deacetylase/N-Sulfotransferase for the Biosynthesis of N-Sulfated Heparosan. Adv Sci (Weinh). PMID: 42429608.
PMID: 42429608