酵母双通道光遗传学：多路复用光控细胞过程与代谢通路

📅 2026-08-12 📰 Nat Commun 2026 May 22 📂 研究进展 👁 19

来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space

导读

光遗传学利用光在基因水平控制细胞功能，已在细胞生理研究、生物材料和代谢工程中展现应用价值。酿酒酵母是工业相关模式生物，但因所需基因数量多及不同波长光之间的交叉激活问题，多波长光遗传学一直未在该菌中实现。本研究开发了仅需单基因、无需外源辅因子的紧凑型红光响应光遗传系统，并通过模块化蛋白结构域工程降低蓝光交叉激活，与EL222蓝光系统整合建立双通道光遗传平台，实现了黄酮类化合物木犀草素的合成调控及絮凝沉降辅助产物提取，并在生物被膜上印制双色图案。

研究背景

光遗传学是合成生物学新兴领域，相比化学方法控制细胞功能具有避免有害化学品、与生物系统正交、动态可控及空间分辨率等优势。目前已开发出覆盖红光、蓝光、绿光及紫外光等多种波长的光遗传系统，多色光多路复用有望实现对不同细胞过程的独立正交控制。尽管多路复用光遗传学已在大肠杆菌和哺乳动物神经元中实现，但由于缺乏紧凑型正交光遗传系统及不同颜色光之间的交叉激活问题，酿酒酵母仅应用了单一波长的单通道光遗传学。酿酒酵母作为强大的模式生物，已被广泛应用于化学品生产、药物、生物燃料、生物材料、环境诊断、替代食品及临床治疗等多种合成生物学应用。

研究方法

将双通道光遗传学应用于生物材料图案化

本研究中双通道光遗传学的最终应用是利用光遗传学的空间分辨率。利用光模式在特定位置激活细胞中基因表达的能力已广泛应用于生物材料、神经科学及微生物群落互作研究。展示光遗传学空间特性的常用方法是将图像投影到带有荧光或彩色基因产物、且基因受光敏感启动子调控的细胞菌苔上，从而将图像"印制"到细胞上。虽然大肠杆菌已实现多色图像，但酿酒酵母仅能通过单通道光遗传学实现单色图像。

为实现多色图像，从OY-β.mA1LINX构建了OY-γ.RB（红-蓝）菌株。lacZ酶被指定为蓝光通道的输出，CrtI被指定为红光通道的输出。在蓝光存在下，X-Gal被催化为蓝色染料（5,5'-二溴-4,4'-二氯靛蓝）；在红光存在下，CrtI完成橙色β-胡萝卜素的生物合成（图8a和补充图15）。

▲ 将细胞悬浮液铺在YNB琼脂上，蒸发过夜形成细胞层。平板先通过掩膜暴露于5%红光下24小时，再通过掩膜暴露于100%蓝光下24小时。a OY-γ.RB（红-蓝）基因回路。b 压印出字母“I SEE YOU”。c NUS iGEM 2021标志PRYSM的压印。d 电影《小行星城》（韦斯·安德森执导，2023）中角色Augie Steenback一帧画面的压印。

OY-γ.RB在琼脂上生长为薄层细胞，使用Optobox将不同图像投影到表面（补充图16）。图案被切割成黑色纸张作为滤光片，选择性地用红光照射24小时，再用蓝光照射24小时。研究发现，在这种情况下不需要近红外光来消除交叉激活（补充图17）。利用这种方法，研究团队成功印制了从字母到标志及精细图像的多种多色图案，展示了该系统开发复杂活体材料的高空间分辨率和潜力。

光强度操作单元

光强度的操作单元在补充说明15中详述。Optobox装置配备特定波长的LED阵列，通过PWM（脉冲宽度调制）控制光强度百分比。100%光强度对应LED最大功率输出，百分比值表示PWM占空比，而非绝对辐照度。补充图19提供了各光强度条件下的实际光功率测量值。

研究结果

在酿酒酵母中开发单组分红光通道

多种红光响应转录因子已开发用于酿酒酵母、细菌和哺乳动物细胞。然而，其缺点包括需要整合多个基因、添加外源辅因子，或需要额外基因进行辅因子的内源合成。考虑到双通道系统中过多基因可能对细胞造成代谢负担并增加克隆难度，研究团队寻找一种能利用内源辅因子的功能性单组分红光敏感转录因子。虽然据其所知尚无此类系统在酿酒酵母中实现，但iLight系统此前已在大肠杆菌和哺乳动物细胞中开发。iLight是一种单组分远红光转录因子，通过工程改造光敏IsPadC BphP蛋白（Idiomarina sp. A28L藻红素激活二鸟苷酸环化酶）衍生而来。该蛋白由DNA结合域与IsPadC BphP的进化光敏核心模块（PCM）融合组成，PCM形成同源二聚体阻止DNA结合域二聚化。暴露于红光（660 nm）时，PCM构象改变允许DNA结合域二聚化，从而结合同源DNA序列。相反，近红外光（770 nm）诱导从激活态向失活态转变（图1c）。iLight在哺乳动物细胞中不需要外源辅因子，因为它依赖内源产生的胆绿素IXa。因此，研究团队推断其在酿酒酵母中同样功能正常，因为酿酒酵母表达天然血红素加氧酶Hmx1，可催化胆绿素的产生。

▲ a 双通道光遗传学将能够对生物制造中所用生物的代谢流进行多功能控制，并可用于更复杂的工艺和优化。b 光遗传学在活体材料工程中具有潜在应用价值，通过两个光通道，可以控制活体材料上多个基因的局部表达。c 描述我们y-iLight红光通道的机制。d 描述EL222蓝光通道的机制。

细菌中展示的iLight版本不能直接应用于酿酒酵母，因为该蛋白缺乏在真核生物中发挥功能所需的激活域和核定位序列。此外，哺乳动物细胞中展示的版本也不理想，因为它利用酿酒酵母Gal4 DNA结合域，与酿酒酵母生物学不具正交性。为工程改造适用于酿酒酵母的系统，研究团队将iLight哺乳动物变体的Gal4 DNA结合域替换为LexA蛋白。LexA常用于正交合成酿酒酵母转录因子。由于细菌变体利用突变型LexA域，研究团队推断野生型LexA的蛋白构象应具有类似功能。由于原始SV40 NLS在N端与Gal4域融合，SV40 NLS被重新附加到C端，产生了命名为y-iLight的合成酿酒酵母转录因子。Y-iLight克隆在组成型酿酒酵母GAP1启动子（PGAP1）下游，并整合到酿酒酵母基因组位点YORWd17。同源启动子改编自Stelling等人，由8个串联lexO重复序列阵列组成，位于CYC1核心启动子（cPCYC1）上游。为评估不同核心启动子对系统的可能影响，克隆了两个额外质粒，将cPCYC1替换为PGK1或ENO1核心启动子（cPPGK1或cPENO1）。这些启动子分别命名为PlexCYC1、PlexPGK1和PlexENO1，克隆在低拷贝附加体质粒上mCitrine荧光报告基因上游，并转化到表达y-iLight的酵母中（图2a）。

▲ a Genetic circuit of the iLight protein adapted to S.cerevisiae as a red light optogenetic system. b Expression of mCitrine fluorescent reporter through y-iLight paired with a lexO array upstream of various core promoters in comparison to constitutive P ACT1 . BY474R cells were cultured at 30 °C in

所有3种转化体在光遗传光箱（Optobox，设备规格见补充说明15）上以0%、2.5%、10%、25%、50%和100%红光强度培养。ACT1启动子（PACT1）是酿酒酵母中常用的特征明确的启动子。为评估工程启动子是否能驱动足够水平的基因表达以满足实际应用，将其活性与PACT1进行比较。因此，用y-iLight启动子替换为组成型PACT1、上游连接mCitrine报告基因的质粒作为对照，同样在0%、25%、50%和100%红光强度下培养。与黑暗培养的细胞相比，所有三种y-iLight响应质粒在暴露于各光强度红光时均观察到表达增加（图2b）。这表明iLight已成功重构为在酿酒酵母中工作，无需任何额外辅因子。

不同核心启动子导致不同水平的报告基因表达，研究注意到PlexCYC1和PlexPGK1在红光强度超过10%时y-iLight活性下降，而PlexENO1在红光强度大于50%时出现类似下降。所有条件下培养物的OD600均未显示生长缺陷（补充图1a），表明红光未对细胞活力产生负面影响。由于这种非线性行为在三种核心启动子中均存在，很可能是y-iLight转录因子本身的伪影。红光启动子非线性行为的一个可能解释是活性y-iLight的空间位阻，阻止其他转录因子和转录元件结合，因为转录激活因子在核心启动子附近结合已被证明会因干扰RNA聚合酶结合而降低表达。另一种可能机制是"促进扩散"，即由于转录因子在DNA链上拥挤，虽然初始结合速率增加，但转录因子停留时间减少，导致启动子表达不佳。两种提出的机制都会表现为高浓度活性转录因子存在下启动子表达降低。

三种启动子可能对光具有不同敏感性，因为核心启动子包含RNA聚合酶结合位点、转录起始位点以及DNA区域——该区域是转录机制组装和启动所必需的。PlexCYC1和PlexPGK1在较低光强度下即达到饱和，而PlexENO1在较高光强度下仍能维持活性，表明核心启动子序列对光遗传系统的剂量-响应曲线具有显著影响。这一发现为未来光遗传系统的启动子选择提供了重要参考——不同的核心启动子不仅影响基础表达水平，还影响光响应动态范围。

蓝光通道与红光通道的正交性验证

在建立双通道系统之前，研究团队验证了红光通道与蓝光通道之间的正交性。将表达y-iLight的BY474R菌株分别暴露于25%红光、25%蓝光或黑暗条件下培养24小时，测量mTurquoise荧光表达。结果表明，红光条件下报告基因表达显著高于蓝光条件，而蓝光条件下的表达与黑暗条件无显著差异（图3a）。这一结果确认了红光通道对蓝光具有良好正交性。

▲ a Expression of mTurquoise by BY474B in response to red light compared to blue light and darkness. Strain was cultured at 30 °C in a shaking incubator while exposed to 25% red light, 25% blue light or darkness. Fluorescence was measured at 24 h and normalized to OD 600 . Values are an average of 3 b

近红外光对y-iLight的影响

为评估近红外光对y-iLight活性的影响，BY474R菌株先在25%红光下培养2小时，然后分别继续暴露于25%红光、50%近红外光或黑暗中3小时。每小时测量荧光并归一化至OD600。结果显示，切换到近红外光或黑暗的细胞荧光表达停止增加，而持续暴露于红光的细胞荧光继续上升（图3b）。这表明近红外光能有效关闭y-iLight的激活状态，实现快速失活。

减少蓝光交叉激活的y-iLight变体工程

尽管红光通道对蓝光正交，但蓝光通道对红光通道可能存在交叉激活。为减少这种串扰，研究团队工程改造了y-iLight的变体。通过引入光诱导核输出序列（LINX）和光敏降解子（degron），实现了模块化工程（图3d）。测试了y-iLightLINX、y-iLightmA1LINX和y-iLightmA6LEXY等变体在不同光条件下的表达（图3e）。结果表明，这些变体在蓝光下的背景表达显著降低，同时保持了红光激活能力。其中y-iLightmA1LINX和y-iLightmA6LEXY在蓝光加近红外光条件下的交叉激活显著减少，而红光激活表达保持稳定（图3f）。

双通道同时控制的剂量-响应表征

为全面表征双通道系统的性能，研究团队构建了OY-α和OY-β系列菌株。OY-α仅含EL222蓝光系统，OY-β.LINX、OY-β.mA1LINX和OY-β.mA6LEXY同时含有蓝光和红光系统。在增加蓝光强度（0-100%）并伴随50%近红外光的条件下，mTurquoise（蓝光通道输出）和mCitrine（红光通道输出）的表达如图4a和4b所示。在增加红光强度（0-100%）的条件下，两种报告基因的表达如图4c和4d所示。

▲ a mTurquoise的表达和b mCitrine在OY-α、OY-β.LINX、OY-β.mA1LINX及OY-β.mA6LEXY中随蓝光加近红外光强度增加的表达。菌株在30°C摇床培养箱中培养，暴露于50%近红外光及0-100%蓝光下。24小时时测量荧光，并归一化至OD 600。数值为3个生物学重复的平均值。误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差。c mTurquoise的表达和d mCitrine在OY-α、OY-β.LINX、OY-β.mA1LINX及OY-β.mA6LEXY中随增强的……

为测试双通道同时激活，菌株暴露于60分钟循环的25%红光后接25%蓝光，或25%红光后接25%蓝光加50%近红外光，以及25%红光和25%蓝光同时照射和三种光同时照射（图4e和4f）。结果显示，双通道系统能够独立响应各自的光信号，同时保持对另一通道的最小交叉激活。

双通道光遗传学在木犀草素合成中的应用

为展示双通道光遗传学的实际应用价值，研究团队将其应用于黄酮类化合物木犀草素的合成调控。木犀草素由柚皮素通过菱形途径经两步酶促转化合成（图5a）。构建了OY-γ.LutB/R(D)菌株，其中蓝光通道控制F3'H（黄酮-3'-羟化酶）表达，红光通道控制FNSI（黄酮合酶I）表达（图5b）。

▲ a 通过菱形途径将柚皮素酶法转化为木犀草素。b OY-γ.LutB/R(D)的基因回路。c OY-γ.LutB/R(D)在红光与蓝光加近红外光交替循环中的类黄酮产量。菌株在30 °C摇床中培养，循环周期为120 min，第一个数字表示暴露于蓝光加近红外光的分钟数，第二个数字表示暴露于红光的分钟数。24 h后提取类黄酮并通过HPLC表征。数值为3个生物学重复的平均值。误差棒表示标准差。

在不同红光和蓝光加近红外光循环条件下培养OY-γ.LutB/R(D)，循环周期为120分钟，第一个数字表示暴露于蓝光加近红外光的分钟数，第二个数字表示暴露于红光的分钟数。24小时后提取黄酮类化合物并用HPLC表征。结果显示，光照循环比例显著影响木犀草素产量（图5c）。RT-qPCR结果证实了F3'H（图5d）和FNSI（图5e）的表达受光照循环调控，以UBC6管家基因归一化后，各光照条件的ΔCt与黑暗条件比较的差异绘制在图上。

在12小时25%蓝光加50%近红外光后接12小时25%红光的条件下（图5f），以及12小时25%红光后接12小时25%蓝光加50%近红外光的条件下（图5g），每6小时提取黄酮类化合物并用HPLC表征。结果表明，光照顺序和比例能够精确调控木犀草素的合成时序和产量。

动力学模型模拟

为深入理解双通道调控机制，研究团队建立了数学模型（图6b），模拟暴露于一个循环中不同比例蓝光加近红外光后接红光的黄酮浓度（图6a），预测不同占空比下120分钟周期24小时内的黄酮水平（图6c），以及12小时光照循环下的时间响应曲线（图6d）。计算模型预测与实验数据的R²（决定系数）值用于评估模型准确性（图6e）。

▲ a Simulated flavonoid concentrations when exposed to one cycle varying proportions of blue plus NIR(Near-Infrared) light followed by red light illumination ( n = 1). b A schematic diagram of the model elucidating the regulatory mechanisms and reaction kinetics of the two pathways for producing luteo

生长-生产-提取三相生物制造

为简化产物提取流程，研究团队设计了生长-生产-提取三相生物制造工作流程（图7a）。构建了OY-γ.LutFlo菌株，将絮凝基因整合到双通道光遗传系统中（图7b）。在黑暗中48小时、50%近红外光48小时，或24小时25%蓝光加50%近红外光后接24小时25%红光的条件下培养，观察絮凝现象（图7c）。

▲ a 生长-生产-提取三阶段生物制造的工作流程。b OY-γ.LutFlo的基因回路。c OY-γ.LutFlo在不同光照条件下的絮凝照片。培养物在振荡培养箱中30°C下分别置于黑暗中48 h、50%近红外光下48 h、25%蓝光加50%近红外光下24 h后再经25%红光24 h处理

上清液OD600测量显示，OY-γ.LutFlo在红光诱导后发生絮凝，细胞沉降导致上清液OD600显著下降，而对照菌株OY-γ.LutB(D)未显示絮凝（图7d）。木犀草素产量表征显示，OY-γ.LutFlo在24小时蓝光加近红外光后接6小时红光条件下，30小时时上清液（Top Fraction）和含絮凝物培养液（Bottom Fraction）中的黄酮浓度分布表明絮凝有效富集了产物（图7e）。统计检验p值如下：(i)−0.00421，(ii)−0.777（NS），(iii)−0.00562，(iv)−0.00378，(v)−0.000331。

讨论与解读

本研究成功开发了酿酒酵母单组分红光光遗传系统y-iLight，仅需单个转录因子且不依赖任何外源添加的辅因子，填补了酿酒酵母缺乏紧凑型单组分红光光遗传系统的空白。与此前开发的PhiReX系统相比——后者需要表达四种不同基因，包括酿酒酵母非内源辅因子的生物合成基因——y-iLight仅需单基因且利用内源胆绿素，极大简化了系统复杂度。PhiReX 1.1实现了41倍诱导，PhiReX 1.0实现了11倍诱导但强度约为PADH1的2倍，而y-iLight具有26倍诱导倍数，活性与PACT1相当，动态范围介于PhiReX 1.0和1.1之间。

蓝光与红光通道间的交叉激活是影响双通道光遗传学活性的意外障碍。y-iLight的光敏辅因子胆绿素在基态吸收可见光谱红光范围，这可能是交叉激活的根源。通过模块化蛋白工程引入光诱导核输出序列和光敏降解子，研究团队成功降低了蓝光对红光通道的交叉激活。

编译者解读

本研究的技术亮点在于"化繁为简"——将原本需要多基因、多辅因子的红光系统压缩为单基因自足模块，为多路复用扫清了代谢负担障碍。双色图案印制实验令人印象深刻，直接在活细胞菌苔上"打印"出多色图像，这种空间分辨率为活体材料制造提供了直观范本。从应用角度看，将光控与絮凝耦合实现"光控产物回收"，巧妙规避了传统细胞破碎和产物提取的繁琐流程。局限在于光穿透深度问题——对不透明发酵体系而言，光传递效率仍是工程放大的瓶颈。未来若能与流动化学或光导纤维反应器结合，该双通道系统在精细化学品生产中的潜力值得期待。

参考来源

Tan LYH, Lin Z, Yeoh JW, Zhang J, Poh CL. Dual-channel optogenetics in yeast for multiplexed light-based control of cellular processes and pathways. Nature Communications. PMID: 42173879.

PMID: 42173879

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