来源：J Agric Food Chem | 编译：DNA Lab Space
黑森林国家公园的朽木上，一种不起眼的白色真菌正在悄然合成一种红色化合物。这种名为卵孢霉素（oosporein）的红色二苯醌类物质，有望成为替代化学农药的生物防治剂。德国研究人员从受保护区域的针叶朽木中分离出离心状原毛平革菌（Phlebia centrifuga），通过建立液体深层发酵体系，最高获得每升1.60克的目标产物，并借助多组学与分子动力学模拟，成功预测了其完整生物合成途径。该研究发表于《农业与食品化学杂志》。
研究背景
化学农药在保障作物产量方面功不可没，但其对非靶标生物和生态环境的负面影响日益受到关注。生物防治剂因其环境友好特性，被视为替代化学农药的重要方向。卵孢霉素作为一种红色二苯醌类化合物，展现出良好的杀虫活性，在农业害虫防治中具有应用潜力。然而，天然来源的卵孢霉素产量有限，限制了其规模化应用。
此前研究虽已鉴定出卵孢霉素的化学结构，但对其生物合成途径的认识仍不完整。特别是在产生菌株中，负责各步转化的关键酶尚未明确。本研究从德国黑森林国家公园的原始保护区域采集样本，旨在建立高效生产平台，并阐明其生物合成机制。选择受保护区域的稀有真菌作为研究对象，为挖掘新型生物合成酶提供了独特视角。
研究方法
菌株分离与纯化
研究团队在黑森林国家公园原“Wilder See”保护区内，从针叶朽木（云杉/冷杉死木）上采集了离心状原毛平革菌的子实体，样本编号KR-M-0090335，地理坐标为北纬48.5690953°、东经8.2377273°。通过孢子脱落法，在麦芽酵母蛋白胨琼脂培养基上获得纯培养物。该培养基配方为：麦芽提取物7 g/L、酵母提取物0.5 g/L、大豆蛋白胨1 g/L、琼脂15 g/L。待菌丝覆盖平板约80%面积后，切取1×1厘米的带菌琼脂块，转接至麦芽提取物琼脂（MEA）平板（麦芽提取物30 g/L、琼脂15 g/L）上长期保藏。该菌株已保藏于DSMZ菌种保藏中心，编号DSM 121802。
化学试剂
实验所用化学试剂均购自专业供应商。琼脂、硼酸（99.8%）、D-葡萄糖一水合物、氘代二甲亚砜（DMSO-d6，99.9%原子氘代率）、2-丙醇、一水硫酸镁（99%）、磷酸（85%）、氢氧化钠（98%）、三乙胺（99.5%）及酵母提取物购自Carl Roth公司（德国卡尔斯鲁厄）。乙腈（99.9%）、乙醇（99.9%）、甲酸（99.9%）、麦芽提取物、磷酸二氢钾（99.5%）及乙酸钠购自Th. Geyer公司（德国雷宁根）。冰醋酸、DMSO（99%）、一水苔色酸（98%）、马铃薯提取物及氯化钠（99.5%）购自Fisher Scientific公司（德国施韦尔特）。大豆蛋白胨和甲醇（99.9%）购自Merck公司（德国达姆施塔特）。玻璃纸购自Diagonal公司（德国明斯特），L-天冬酰胺一水合物购自AppliChem公司（德国达姆施塔特）。卵孢霉素参考标准品（70%纯度）购自Cayman Chemical公司（美国密歇根州安娜堡）。括号内数字分别表示最低纯度和最低氘代率。
液体发酵与产物提取
将菌株在PD培养基中进行液体深层培养。培养过程中，培养上清液呈现红色，与野生子实体边缘或吐水液滴的颜色一致。红色素从培养上清液中分离纯化，具体提取步骤原文摘要未详述。
产物结构鉴定
分离得到的红色化合物通过高分辨质谱（HRMS）和核磁共振（NMR）进行结构确认。HRMS分析采用Bruker Impact II电喷雾电离质谱仪，在ESI(+)模式下检测，获得质荷比（m/z）307.0446 [M+H]+和329.0267 [M+Na]+两个主要离子峰，由此计算出精确分子量为306.0373 Da，对应分子式C14H10O8（质量偏差Δ = −0.87 ppm），与卵孢霉素的分子式一致。
1H NMR谱图显示一个位于δ = 1.81 ppm（单峰，6H）的信号，归属为C7/C7′位的甲基质子。在DMSO-d6中测定的13C NMR谱仅显示三个信号，分别位于δ = 7.6、107.4和112.8 ppm，对应14个碳原子中的6个：两个甲基碳（C7/C7′）以及四个季碳（C1/C1′和C4/C4′）。羟基和羰基碳的信号因互变异构而明显展宽，与文献报道的卵孢霉素行为一致。为获得清晰的碳谱信号，研究者在13C NMR测定中加入2摩尔过量的三乙胺（Et3N）。加碱后的13C NMR谱给出以下信号：δ = 8.0 ppm（C7/C7′）、107.6 ppm（C1/C1′）、108.0 ppm（C4/C4′），以及新增的171.4 ppm（羟基取代的碳原子C2、C5/C2′、C5′）和172.3 ppm（羰基碳）信号。
多组学分析与酶功能预测
研究采用多组学方法，预测编码所有必要转化步骤的酶基因。分析鉴定出三类关键酶：I型聚酮合酶（type I polyketide synthase）、两种单加氧酶（monooxygenase）以及一种血红素过氧化物酶（heme peroxidase）。原文摘要未详述转录组学、蛋白质组学等具体组学数据的获取平台与分析参数。
分子对接与分子动力学模拟
对预测酶的催化功能进行了广泛的分子对接分析和分子动力学模拟研究。原文摘要未提供具体的软件名称、力场参数、模拟时间尺度等细节。通过计算模拟，最终推导出卵孢霉素生物合成途径的完整框架。
研究结果
卵孢霉素的高效生产
在PD培养基中添加关键中间体苔色酸（orsellinic acid）后，离心状原毛平革菌的培养上清液中卵孢霉素产量最高达到1.60 g/L。苔色酸的添加强烈诱导了卵孢霉素特异性生物合成基因的表达。这一产量在已报道的卵孢霉素生产体系中处于较高水平。
产物结构确证
综合HRMS和NMR数据，从培养上清液中分离的红色化合物被明确鉴定为卵孢霉素。HRMS给出的精确分子量306.0373 Da与理论值高度吻合（Δ = −0.87 ppm），分子式C14H10O8确认无误。1H和13C NMR谱图特征与卵孢霉素的对称二聚结构完全匹配。加入三乙胺后获得的碳谱信号清晰分辨出所有碳原子类型，进一步证实了结构归属。
生物合成途径的预测
多组学分析预测了参与卵孢霉素生物合成的全套酶系，包括I型聚酮合酶、两种单加氧酶和一种血红素过氧化物酶。分子对接和分子动力学模拟结果支持这些酶在催化各步转化中的功能角色。研究据此提出了完整的生物合成途径：I型聚酮合酶首先催化起始单元组装形成苔色酸骨架，随后经两种单加氧酶的连续氧化引入羟基，最后由血红素过氧化物酶催化二聚化反应形成最终的卵孢霉素结构。原文摘要未提供各酶催化反应的具体动力学参数或中间产物结构信息。
生产平台的特征
该研究建立的生产平台具有三个显著特征：无孢子形成、高产率、可规模化。与传统的固体培养或表面培养相比，液体深层发酵更易于放大和过程控制。苔色酸作为诱导剂和前体的双重作用，为产量优化提供了简便有效的策略。该平台展示了稀有受保护真菌物种作为有价值酶源和生物活性次级代谢产物来源的巨大潜力。
讨论与展望
本研究的一个亮点在于选择了来自国家公园保护区域的稀有真菌作为生产菌株。这一选择并非偶然——受保护区域的生态系统往往保存着独特的微生物多样性，这些微生物可能进化出特殊的代谢途径。研究结果证实，离心状原毛平革菌确实具备高效的卵孢霉素合成能力，且其生物合成酶系具有良好的催化性能。
苔色酸添加策略的巧妙之处在于，它既是生物合成的前体，又是基因表达的诱导剂。这种双重作用机制使得产量提升效果显著——从基础水平跃升至1.60 g/L。不过，该研究目前仍停留在摇瓶水平，发酵罐放大过程中的氧传递、剪切力、营养供给等参数对产量和产物纯度的影响尚需系统考察。
分子动力学模拟在酶功能预测中发挥了关键作用。对于难以异源表达或结晶的膜结合酶或分泌酶，计算模拟提供了一种可行的功能预测手段。然而，模拟预测的酶功能仍需通过体外生化实验或基因敲除/回补实验进行最终验证。这也是该研究后续值得关注的方向。
从应用角度看，卵孢霉素作为生物防治剂，其杀虫谱、田间稳定性、对非靶标生物的安全性等关键指标尚需全面评估。该生产平台的建立，为这些后续研究提供了稳定的化合物来源。稀有真菌物种作为生物制造资源的潜力，也在这项研究中得到了有力印证。
参考来源
Broel N, Wengner FV, Stein JV, Popa F, Janssen S. Oosporein in Phlebia centrifuga: Prediction of Key Enzymes by a Combination of Multi-Omics and Molecular Dynamics. J Agric Food Chem. PMID: 42554813.
PMID: 42554813