来源：Microb Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
混合连接β-葡聚糖（MLG）因其独特的结构流变学特性，正成为合成生物学领域备受关注的生物聚合物。然而，其生物合成机制中仍有一块关键拼图缺失——负责聚合物合成与分泌的完整分子机器究竟由哪些组分构成？一项发表于《Microbial Biotechnology》的最新研究给出了出人意料的答案：外膜蛋白TolC竟在其中扮演不可或缺的角色。该研究不仅揭示了TolC与BgsA、BgsB形成三组分复合物共同完成MLG合成与转运的新机制，还通过共过表达策略将MLG产量推高至生物反应器条件下的约10 g/L，并在非天然产MLG的根瘤菌宿主中实现了从无到有的异源合成。
研究背景
MLG是一类由β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成的线性多糖，广泛存在于禾本科植物细胞壁及部分细菌胞外分泌物中。在细菌中，尤其是根瘤菌属，MLG的生物合成受第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）的严格调控，并由双顺反子操纵子bgsBA介导。已有的研究表明，BgsA负责糖基转移酶活性，BgsB则可能参与聚合物的跨膜转运。然而，完整的生物合成机器组成——特别是聚合物如何高效跨越外膜分泌至胞外——以及如何进一步提升产量的策略，始终是悬而未决的问题。这一瓶颈限制了MLG作为可降解生物材料、膳食纤维及医药载体等应用场景的规模化生产。
研究方法
菌株与培养条件
研究团队使用了多种根瘤菌作为研究对象，包括苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）、日本中生根瘤菌（Mesorhizobium japonicum）以及菜豆根瘤菌（Rhizobium etli）。常规培养采用添加3.40 mM CaCl₂·2H₂O的胰蛋白胨-酵母提取物培养基（TY）或最小培养基（MM）。MM培养基每升含：10 g甘露醇、1.1 g谷氨酸钠、0.3 g KH₂PO₄、0.3 g K₂HPO₄、0.15 g MgSO₄·7H₂O、0.05 g CaCl₂·2H₂O、0.006 g FeCl₃、0.05 g NaCl，并补加1 mL的1000×维生素储备液（含0.2 g/L生物素、0.1 g/L盐酸硫胺素和0.1 g/L泛酸钠）。S. meliloti和M. japonicum菌株在28°C培养，R. etli在30°C培养。用于克隆和接合转移的大肠杆菌在37°C的LB培养基中培养。
抗生素及筛选试剂的使用浓度如下：四环素（Tc）10 μg/mL（R. etli为5 μg/mL）、卡那霉素（Km）50 μg/mL、刚果红（CR）50 μg/mL、荧光增白剂（CF）200 μg/mL、IPTG 1 mM。所有质粒均通过大肠杆菌β2163或S17.1供体菌株接合转移导入根瘤菌。
三突变体构建
为探究其他c-di-GMP调控型胞外多糖对MLG产量的影响，研究团队在S. meliloti 8530中构建了三重突变体。通过框内缺失依次敲除了三个基因：wgcA（负责EPS II合成）、exoY（负责EPS I合成）以及uxs1-uxe（负责APS合成）。每步突变均通过PCR进行遗传水平验证，并通过相应EPS表型缺失进行微生物学确认。最终获得的三重突变体命名为IBR606。
MLG定量检测
MLG产量通过地衣多糖酶（lichenase）消化后测定释放的葡萄糖当量来量化。具体操作：将根瘤菌接种于含100 mL三角瓶的20 mL液体MM培养基中（补加适宜浓度的Tc），S. meliloti菌株于28°C、R. etli菌株于30°C条件下，170 rpm振荡培养3天。初始OD₆₀₀调整为0.05。
过表达模块构建
为提升MLG产量，研究团队构建了包含tolC、bgsBA以及组成型活性二鸟苷酸环化酶基因pleD\的共过表达模块。其中，pleD\通过表达组成型活性的二鸟苷酸环化酶提高胞内c-di-GMP水平，从而激活MLG合成通路。对照质粒不含tolC，用于评估该基因对产量的独立贡献。
生物反应器发酵
在摇瓶验证的基础上，研究团队进一步在生物反应器条件下评估了最优菌株的MLG产量。原文摘要未详述反应器的具体型号、工作体积、搅拌转速、通气量及pH控制策略等参数。
研究结果
其他c-di-GMP调控型EPS并非MLG产量的主要制约因素
在生理c-di-GMP水平下，野生型S. meliloti 8530的MLG产量低于检测限。三重突变体IBR606（ΔwgcA ΔexoY Δuxs1-uxe）的背景中，MLG产量相对于野生型未见显著提升。当引入质粒pJBpleD\（表达组成型活性二鸟苷酸环化酶，提高胞内c-di-GMP水平）后，IBR606的MLG产量显著提升，略高于野生型携带同一质粒的水平，但该差异无统计学意义。这一结果表明，S. meliloti*合成EPS I、EPS II和APS的能力对MLG产量并无重大影响——换言之，竞争性碳流并非限制MLG高效合成的瓶颈。
TolC是MLG生物合成的必需组分
遗传学证据清晰地表明TolC的关键地位：tolC基因的遗传破坏完全消除了MLG合成，而回补该基因则恢复了MLG生产能力。这确立了TolC作为MLG生物合成机器的核心组分，而非辅助因子的地位。研究团队据此提出，TolC与BgsA、BgsB共同构成三组分复合物，协同完成聚合物的合成与/或分泌——TolC作为外膜蛋白，很可能充当了聚合物穿越外膜的通道。
共过表达策略实现8倍产量提升
将tolC、bgsBA和pleD\**共过表达，相较于不含tolC*的对照质粒，MLG产量实现了8倍的提升。在生物反应器条件下，该工程菌株的MLG产量达到约10 g/L。这一数据充分证明了TolC在MLG高效合成中的限速作用——缺乏该外膜蛋白时，即便上游合成通路被充分激活，产量仍受严重制约。
模块化设计实现异源宿主中的从头合成
该遗传模块的另一个突出优势在于其可移植性。将tolC-bgsBA-pleD\**模块导入原本不产MLG的根瘤菌宿主——日本中生根瘤菌（M. japonicum），成功实现了MLG的从头合成（de novo production）。这一结果表明，该模块并非仅适用于天然产MLG的S. meliloti，而是可以作为一套功能完整的“合成盒”在不同细菌底盘间转移。原文摘要未提供M. japonicum*异源表达的具体产量数值。
讨论与展望
TolC在MLG生物合成中的必需性，为理解细菌多糖分泌机制提供了新的视角。在革兰氏阴性菌中，TolC家族蛋白通常作为RND型外排泵的外膜通道组分，参与多种底物（包括药物、毒素和蛋白质）的跨膜转运。该研究发现TolC直接参与一种结构性多糖的合成与分泌，拓展了人们对TolC功能谱系的认知。三组分复合物模型——BgsA负责糖链延伸、BgsB可能介导内膜转运、TolC充当外膜通道——勾勒出一条跨越周质的聚合物分泌路径。
从应用角度审视，8倍产量提升与10 g/L的生物反应器产量，使MLG的工业化生产迈出了实质性一步。模块在不同根瘤菌宿主间的成功移植，更意味着合成生物学“即插即用”的理念在多糖生产领域得到了又一次验证。未来若能将这一模块引入生长更快速、遗传操作更成熟的工业生产菌株（如大肠杆菌），并配合发酵工艺优化，MLG的规模化应用前景值得期待。当然，TolC与BgsA/BgsB之间的具体分子互作模式、三组分复合物的组装动力学等问题，仍有待结构生物学和生化实验的进一步阐明。
参考来源
Ruiz-Sáez L, Pacheco PJ, Peinado J, Lloret J, Muñoz S. TolC Is Required for a Mixed-Linkage β-Glucan (MLG) Biosynthesis: Engineering Bacteria for MLG Overproduction. Microb Biotechnol. PMID: 42552791.
PMID: 42552791