来源：Appl Microbiol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
木质纤维素生物质是替代化石资源的重要可再生原料，但其预处理产生的低pH、高温及发酵抑制物环境对微生物宿主提出了严苛要求。本研究以具有卓越多重胁迫耐受性的非常规酵母东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）为宿主，发现模式酵母酿酒酵母的展示组件在该酵母中失效后，基于内源 IoSED1 基因构建了适配的细胞表面展示盒，成功实现了增强绿色荧光蛋白和β-葡萄糖苷酶的表面展示。展示菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长，且在木质纤维素发酵抑制物存在下仍维持生长，为木质纤维素生物转化提供了新的工业平台。
研究背景
气候变化加剧与石油资源枯竭推动了对非化石基可持续生产体系的需求。木质纤维素生物质（LCB）——包括稻草、玉米秸秆、木片、甘蔗渣等农业残余物——因储量丰富且不与粮食作物竞争，成为最具潜力的替代原料。LCB主要由纤维素（占总量40–50%）、半纤维素（20–40%）和木质素三种结构聚合物组成，前两者经化学和酶处理可水解为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等可发酵单糖，再经代谢工程微生物转化为生物基化学品和燃料。
酵母是LCB生物转化中的优良宿主，具有抗噬菌体感染、遗传操作简便、异源蛋白表达能力强等优势。然而，多数模式酵母（如酿酒酵母）缺乏天然水解纤维素和半纤维素的能力，需要引入外源水解酶。通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白的锚定域将纤维素酶展示于酵母细胞表面，可将酶生产、糖化和发酵整合为单一步骤。但LCB的酸性热化学预处理会带来低pH、高温及发酵抑制物（糠醛、5-羟甲基糠醛、香草醛等）并存的多重胁迫环境，要求展示纤维素酶的宿主菌株具备出色的胁迫耐受性。
研究方法
菌株与培养基
大肠杆菌NovaBlue菌株（Novagen，美国威斯康星州）用作重组DNA操作宿主。大肠杆菌转化子在添加100 µg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L氯化钠）中于37 °C培养。本研究所用11株东方伊萨酵母野生型菌株购自日本NITE生物资源中心（NBRC，东京），酿酒酵母野生型菌株为BY4741（Life Technologies，美国加利福尼亚州）。所用酵母菌株及转化子的遗传特性汇总于补充表S1。酵母生长培养基为酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基（YPD，含10 g/L酵母提取物、20 g/L Bacto-蛋白胨[Difco Laboratories，美国密歇根州]、20 g/L葡萄糖）、缺尿嘧啶的合成完全（SC-URA） dropout培养基（6.7 g/L无氨基酸酵母氮源碱[Difco Laboratories]、1.92 g/L无尿嘧啶酵母合成dropout培养基补充物[Sigma-Aldrich，美国密苏里州]、20 g/L葡萄糖）或合成葡萄糖（SD）培养基（6.7 g/L无氨基酸酵母氮源碱[Difco Laboratories]、20 g/L葡萄糖）。
东方伊萨酵母NBRC1664的胁迫耐受性分析
为分析低pH和高温耐受性，将东方伊萨酵母和酿酒酵母细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养48 h，然后以初始光密度（OD600）0.05接种至5 mL SC培养基。SC培养基初始pH分别用1 M HCl和0.5 M KOH调节至2或6。培养在L形管中于30 °C或45 °C、40 rpm条件下进行72 h，使用Bio-photorecorder TVS062CA（ADVANTEC，东京，日本）监测。为评估对木质纤维素发酵抑制物（糠醛、5-HMF和香草醛）的耐受性，细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养24 h。用Milli-Q水制备系列稀释液（OD600分别为1、0.1、0.01或0.001），各取3 µL点样于添加了尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸及一种抑制物（糠醛21 mM；5-HMF 28 mM；香草醛10 mM）的SD琼脂平板上。平板于30 °C培养96–120 h，使用凝胶成像系统FAS-X（Nippon Genetics，东京，日本）记录菌落生长。
东方伊萨酵母NBRC1664尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建
使用Kaneka Easy DNA Extraction Kit版本2（Kaneka，大阪，日本）提取东方伊萨酵母NBRC1664基因组DNA。分别以URA3-UP-F/URA3-UP-R引物和URA3-DOWN-F/URA3-DOWN-R引物（Xiao等，2014）通过聚合酶链式反应（PCR）扩增东方伊萨酵母 URA3（IoURA3）开放阅读框（ORF）的上游（543 bp）和下游（279 bp）同源臂。通过重叠延伸PCR融合这些片段，将所得DNA片段导入NBRC1664。转化子在添加1 mg/mL 5-氟乳清酸（5-FOA）的SC琼脂平板上筛选。使用Colony-P-F和Colony-P-R引物通过菌落PCR确认 IoURA3 ORF的删除。为验证尿嘧啶营养缺陷型，将转化子在含或不含尿嘧啶（76 µg/mL）的SD琼脂平板上划线并于30 °C培养。
细胞表面展示盒的构建
所有质粒均使用In-Fusion试剂盒（TaKaRa Bio，滋贺，日本）按制造商说明书构建。所用质粒和引物分别汇总于补充表S2和S3。
以URA3-F和Colony-P-R引物通过PCR从东方伊萨酵母NBRC1664基因组DNA扩增 IoURA3 基因DNA片段。将扩增片段导入酵母着丝粒穿梭载体pRS415的HindIII位点，获得pVT。以ScSED1p-F和ScSAG1t-R引物通过PCR从质粒pleGFP-SSS（Inokuma等，2020）扩增增强绿色荧光蛋白（eGFP）细胞表面展示基因表达盒，导入pVT的SacI位点，获得质粒pVT-SceGFP。
以IoSED1a-F1和IoSED1a-R1引物通过PCR从东方伊萨酵母NBRC1664基因组DNA扩增 IoSED1 编码区（去除其分泌信号，见表S4）。以质粒plBG-SSS（Inokuma等，2016）为模板，用Vector-F和Vector-R引物PCR扩增DNA片段，将两者融合。所得质粒命名为plBG-SSIoS，其中plBG-SSS的锚定域被替换为IoSED1锚定域。用于以IoSED1启动子、分泌信号和锚定域展示eGFP的质粒构建如下：以IoSED1ps-F1和IoSED1ps-R1引物从东方伊萨酵母NBRC10737基因组DNA通过PCR扩增含 IoSED1 启动子和分泌信号的DNA片段；以eGFP-F和eGFP-R引物从pleGFP-SSS扩增eGFP编码区DNA片段；以IoSED1a-F2和IoSED1a-R2引物从plBG-SSIoS通过PCR扩增编码IoSED1锚定域的DNA片段。将这三个片段导入pVT的SacI位点，生成质粒pVT-IoeGFP。
用于将基因导入东方伊萨酵母NBRC1664先前鉴定的染色体2基因间位点（IS2）（Lee等，2022）的整合型质粒构建如下：分别以IS2-UP-F/IS2-UP-R引物和IS2-DOWN-F/IS2-DOWN-R引物从东方伊萨酵母NBRC1664基因组DNA扩增IS2上游和下游约1 kbp的DNA片段。在IS2-UP-R的重叠区插入PacI识别位点。通过重叠延伸PCR融合这两个DNA片段，获得中心含一个PacI位点的DNA片段。将该片段导入pVT的PpuMI位点，所得质粒命名为pVT-IS。以IoSED1p-F和ScSAG1t-R引物通过PCR从pVT-IoeGFP扩增eGFP展示基因表达盒，将所得片段导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-IoeGFP。
用于细胞表面展示 A. aculeatus BGL1的整合型质粒构建如下：分别以IoSED1ps-F1/IoSED1ps-R2引物和IoSED1a-F2/IoSED1a-R2引物从pVT-IoeGFP扩增IoSED1启动子和分泌信号及IoSED1锚定域的DNA片段。以BGL-F和BGL-R引物通过PCR从plBG-SSS扩增编码 A. aculeatus BGL1的DNA片段。将这三个片段导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-BGL。
细胞表面展示菌株的构建
为构建展示eGFP的东方伊萨酵母菌株，将携带eGFP展示盒的附加型质粒pVT-SceGFP或pVT-IoeGFP导入NBRC1664/ura3Δ菌株，分别获得16-ScGFP-p和16-IoGFP-p菌株。将空载体pVT同样导入NBRC1664/ura3Δ菌株，获得16-pVT菌株。对于eGFP展示盒的基因组整合，用PacI线性化整合型质粒pVT-IS-IoeGFP并整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，获得16-IoGFP-int菌株。类似地，为构建展示BGL的东方伊萨酵母菌株，用PacI线性化整合型质粒pVT-IS-IoBGL并整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，获得16-IoBG-int菌株。
所有东方伊萨酵母菌株均按先前描述的方法（Xiao等，2014）进行醋酸锂法转化，略有修改。酵母细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm过夜培养，取等分试样接种至3 mL新鲜YPD培养基中继续培养。
研究结果
东方伊萨酵母NBRC1664的胁迫耐受性评估
为比较东方伊萨酵母与模式酵母酿酒酵母的多重胁迫耐受性，我们评估了NBRC获得的11株东方伊萨酵母中耐受性最强的NBRC1664菌株（图S1）与酿酒酵母BY4741在低pH、高温及木质纤维素发酵抑制物条件下的胁迫耐受性。如图1a所示，在pH 6条件下两物种均生长良好，但东方伊萨酵母的生长优于酿酒酵母。东方伊萨酵母在pH 2条件下表现出稳健生长，72 h后的OD600与pH 6条件下几乎相同，而酿酒酵母在pH 2条件下无法生长。类似地，东方伊萨酵母在45 °C下成功生长而酿酒酵母不能；两菌株在正常温度30 °C下均生长良好（图1b）。此外，为评估在发酵抑制物（21 mM糠醛、28 mM 5-HMF和10 mM香草醛）存在下的生长情况，进行了点样分析（图1c）。本研究所用各抑制物浓度处于木质纤维素水解液中观察到的范围内（Mills等，2009）。在补充适当营养物的SD培养基非胁迫条件下，两物种均形成明显菌落。当暴露于发酵抑制物时，东方伊萨酵母在全部三种抑制物条件下均成功形成清晰菌落，而酿酒酵母在任何抑制物条件下均无法生长。这些结果与Akita和Matsushika（2024）的报道一致。综上结果表明，东方伊萨酵母NBRC1664具有卓越的多重胁迫耐受性。
展示eGFP的东方伊萨酵母菌株评估
为确定与GPI锚定域融合的蛋白能否固定在东方伊萨酵母细胞表面，我们构建了eGFP展示基因表达盒并通过荧光显微镜检查eGFP信号的定位。首先尝试表达先前在酿酒酵母细胞表面展示eGFP的基因表达盒（Inokuma等，2020），该表达盒由酿酒酵母 SED1（ScSED1）启动子、分泌信号和锚定域及酿酒酵母 SAG1 终止子组成（图2a）。将携带该表达盒的附加型质粒（pVT-SceGFP）导入东方伊萨酵母NBRC1664/ura3Δ菌株——一种尿嘧啶营养缺陷型菌株，其尿嘧啶营养缺陷已通过生长分析确认（图S2），并按"材料与方法"所述进行荧光显微镜观察。然而，未检测到eGFP信号（图2b）。
接下来，我们假设缺乏荧光是由于异源遗传元件在该表达盒中于东方伊萨酵母体内功能不佳所致。细胞表面展示盒的启动子、分泌信号和锚定域对展示效率有决定性影响（Inokuma等，2014，2016；Zhang等，2013）。因此，我们构建了一个修饰型展示盒，将上述各元件分别替换为 IoSED1 基因的对应元件（图2a）。IoSED1 与 ScSED1 基因同源（Kitagawa等，2010），且基于big-PI Fungal Predictor（Eisenhaber等，2004）等预测工具被预测编码GPI锚定蛋白。此外，源自 IoSED1 基因的信号序列已被报道可介导靶蛋白的胞外分泌（Kitagawa等，2010）。将这一新构建的展示盒导入NBRC1664/ura3Δ，荧光显微镜观察显示清晰的表面定位荧光（图2b）。荧光模式与展示eGFP的酿酒酵母菌株（Inokuma等，2020）中观察到的相似，表明eGFP成功展示在东方伊萨酵母细胞表面。
尽管检测到表面定位的eGFP信号，但仅有少数细胞观察到荧光。为提高展示eGFP的细胞比例，我们将展示盒整合至基因组。按"材料与方法"所述构建了设计用于将表达盒插入东方伊萨酵母NBRC1664 IS2位点（Lee等，2022）的整合型质粒，并将eGFP展示盒整合至NBRC1664/ura3Δ菌株。与携带质粒的菌株（16-IoGFP-p）相比，基因组整合菌株（16-IoGFP-int）的荧光显微镜观察显示，表现出清晰表面定位信号的细胞比例大得多（图2b），这与流式细胞术结果一致（图S3）。综上结果表明，成功构建了能够在东方伊萨酵母细胞表面展示靶蛋白的基因表达盒。
展示β-葡萄糖苷酶的东方伊萨酵母菌株评估
接下来，利用所构建的蛋白细胞表面展示基因表达盒，我们构建了展示 A. aculeatus BGL1（可将纤维二糖水解为葡萄糖；Murao等，1988）的东方伊萨酵母菌株，获得16-IoBG-int菌株（图3a）。该菌株在YPD培养基中于30 °C培养72 h，然后在30 °C下评估细胞组分和培养上清液中的BGL活性。16-IoBG-int及其亲本菌株的培养上清液中均未检测到BGL活性。相比之下，16-IoBG-int的细胞组分表现出显著更高的BGL活性（4.35 ± 0.5 mU/OD600），而亲本菌株的细胞组分几乎检测不到活性（图3b）。这表明BGL已成功展示在东方伊萨酵母细胞表面。
此外，为评估所展示的 A. aculeatus BGL1在LCB生物转化预期高温条件（Yanase等，2010）下的活性，将在30 °C培养72 h的细胞于45 °C下进行相同的BGL活性测定。在45 °C下测定时，BGL活性显著增加至30 °C测定值的3倍以上（16.1 ± 1.6 mU/OD600）（图3c）。这一结果与 A. aculeatus BGL1的最适温度处于50 °C以上高温范围的事实一致（Murao等，1988）。
胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源的发酵
为评估所构建的展示BGL菌株能否以纤维二糖为唯一碳源生长，将16-IoBG-int菌株在含1.9%纤维二糖和0.1 M MOPS（pH 6.5）的SC培养基中培养。16-IoBG-int菌株利用纤维二糖生长，而亲本菌株NBRC1664/ura3Δ在该培养基中无法生长（图4a）。培养过程中残留纤维二糖浓度的测定显示，16-IoBG-int菌株培养液中的纤维二糖被消耗，而亲本菌株培养液中的纤维二糖浓度基本保持不变（图4b）。在添加25.4 mM 5-HMF或100 mM乙酸（模拟LCB预处理产生的抑制条件）的同种培养基中，16-IoBG-int菌株仍能生长，而亲本菌株无法生长（图4c、d）。
讨论与解读
本研究开发了适用于多重胁迫耐受酵母东方伊萨酵母的细胞表面展示盒。利用该展示盒，成功构建了在细胞表面展示 A. aculeatus BGL1的菌株，该菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长，且在LCB生物转化相关的多种胁迫条件下仍能同化纤维二糖，表明携带纤维素酶的东方伊萨酵母菌株非常适合高效的LCB生物转化。
研究发现，基于酿酒酵母 SED1 的展示盒在东方伊萨酵母中不发挥作用，而将启动子、分泌信号和锚定域全部替换为 IoSED1 来源的对应元件后，eGFP展示成功。基因组整合较附加型质粒显著提高了展示细胞比例，提示质粒表达在该菌株中固有地不稳定——这与先前报道的酿酒酵母来源着丝粒和自主复制序列在另一株东方伊萨酵母中不稳定的结果一致。值得注意的是，即使在基因组整合菌株中，仍可观察到部分非荧光细胞，且较小尺寸细胞的荧光较弱。
编译者解读
本研究的关键价值在于揭示了"宿主适配"在细胞表面展示中的核心地位——直接移植酿酒酵母的成熟展示盒在东方伊萨酵母中完全失效，而基于内源 IoSED1 基因重构后即获得成功。这一经验对非模式酵母的蛋白展示工程具有普适参考意义。从合成生物学应用角度看，将纤维素酶展示与宿主固有胁迫耐受性结合，省去了外源添加酶制剂的成本，也规避了抑制物存在下酶活衰减的问题。不过，目前展示的BGL活性（4.35 mU/OD600）仍偏低，且非展示细胞比例较高，后续可通过优化启动子强度、锚定域长度或多拷贝整合策略进一步提升展示效率与均一性。
参考来源
Kawahara Y, Nasuno R, Jin YS, Hasunuma T. Engineering a robust cell-surface display platform in the multi-stress-tolerant yeast Issatchenkia orientalis. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 42154235.
PMID: 42154235