来源：3 Biotech | 编译：DNA Lab Space
导读
漆酶作为一种环境友好的生物催化剂，在工业废水处理中备受关注。本研究采用三步相分离法（TPP）从嗜热地衣芽孢杆菌SO8中纯化漆酶，在优化条件下实现5.65倍纯化和102.07%回收率，获得分子量约38.7 kDa的碱性漆酶。该酶在pH 9.0和70°C下表现最佳活性，对多种金属离子和表面活性剂具有良好耐受性，并对六种染料表现出一定的脱色能力。
研究背景
漆酶（苯二酚：氧氧化还原酶；EC 1.10.3.2）是一种含四个铜离子的多酚氧化酶，在将氧气还原为水的过程中，催化单酚、二酚、多酚、芳香族化合物、有机污染物及无机底物的氧化。凭借对多种酚类和非酚类化合物的氧化能力，漆酶已成为纺织、造纸（木质素降解）、污染物脱毒、葡萄酒澄清、有机化学合成、生物传感器及酶生物燃料电池阴极反应等领域的重要工业酶。
漆酶结构中含有约15–40%的碳水化合物（如葡萄糖、甘露糖、己糖胺和阿拉伯糖），这些糖基赋予漆酶较高的稳定性。漆酶单体的分子量通常在50–85 kDa范围内。与真菌和植物来源的漆酶相比，细菌漆酶具有更宽的底物特异性、快速且低成本的制备方式、更宽的适宜pH范围、更强的热稳定性和耐碱性等优势。尽管细菌漆酶的基因组信息不断扩展，但对其具体性质的研究仍然有限。
研究方法
菌株与化学试剂
本研究使用Olmez等人从内夫谢希尔Kozaklı温泉分离的地衣芽孢杆菌SO8菌株（GenBank编号：MG076978）作为漆酶来源。所用化学试剂和溶剂均购自Merck（德国）和Sigma-Aldrich（美国）。
酶活与蛋白测定
漆酶活性采用Wang等人（2014）的改良方法测定。简要流程为：0.5 mL酶液与1 mL含0.5 mM ABTS的100 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）在55°C下孵育15 min。以缓冲液替代酶液作为对照反应。通过分光光度法在420 nm波长下监测ABTS的氧化来测定酶活性。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化1 µmol ABTS所需的酶量。活性计算按照Baltierra Trejo等人（2015）描述的公式进行。蛋白浓度采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品。
漆酶的纯化
将培养液中的细菌细胞连同漆酶通过离心去除（6000 rpm，15 min，4°C）。所得匀浆用作TPP的酶源。漆酶纯化中，首先为达到最高纯化效率，对TPP纯化的参数如硫酸铵浓度（20–80% w/v）、匀浆/叔丁醇比例（1.0:0.5、1.0:1.0、1.0:1.5、1.0:2.0 v/v）和pH（2.0–11.0）进行优化。TPP过程中，首先向2 mL匀浆中加入不同浓度的硫酸铵并缓慢涡旋混匀，然后按不同比例加入叔丁醇并涡旋30 s。混合物在室温孵育1 h，随后6000 rpm离心5 min。离心后观察到三相形成，去除上层叔丁醇，立即将中间相和下层水相分别收集到不同试管中。对中间相和下层水相进行漆酶活性和总蛋白浓度分析。中间相的蛋白沉淀用0.1 M pH 7.0磷酸钠缓冲液溶解。确定硫酸铵和叔丁醇比例后，将匀浆（2 mL）用70%硫酸铵饱和，并用1 M NaOH和1 M HCl调节至不同pH（pH 2.0–11.0），然后加入叔丁醇。按上述方法测定下层相和中间相的漆酶活性和蛋白含量。绘制活性回收率（%）相对纯化倍数的图表。
SDS-PAGE分析
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析确定TPP法部分纯化漆酶的纯度和分子量。电泳过程使用12%（w/v）分离胶和4%（w/v）浓缩胶，基于Laemmli（1970）方法进行。每孔上样20微升样品。凝胶电泳先在250 V下运行5–10 min以确保浓缩效果，然后在120 V下约90 min使蛋白在分离胶中分离。蛋白条带通过银染20 min显色。蛋白分子量标准品（ECOTECH）作为参照。
纯化漆酶的表征
pH和温度的影响
为确定纯化漆酶的最适pH，在0.1 M缓冲液中评估pH 2至12范围内的酶活性。所用缓冲液包括甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.0–3.0）、醋酸钠缓冲液（pH 4.0–5.0）、磷酸盐缓冲液（pH 6.0–7.0）、Tris-HCl缓冲液（pH 8.0–9.0）和甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 10.0–11.0）。为确定纯化漆酶的最适温度，在20至90°C范围内进行酶活性测定。显示最高活性的pH和温度值设为100%用于相对活性计算。为评估pH稳定性，将0.5 mL漆酶在不同pH值的缓冲液中孵育2 h，然后测定残余活性，初始活性设为100%。热稳定性通过在20°C至90°C温度范围内孵育30、60、90和120 min进行评估。在最适pH（pH 5.0）下使用1.5 mL缓冲液、1 mL底物和0.5 mL酶液测定残余活性。初始活性设为100%用于相对活性计算。
金属离子、抑制剂和表面活性剂的影响
为研究某些金属离子对漆酶的影响，使用20 mM的金属离子溶液（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺），向每种金属离子中加入0.5 mL纯化漆酶使终浓度为1、5和10 mM，孵育30 min后测定剩余漆酶活性。以不含任何金属盐的酶活性为100%作为对照。类似地，研究不同表面活性剂和抑制剂对漆酶的影响：Triton X-100、Tween-20、Tween-80浓度为1%、5%和10%，SDS浓度为5、10和20 mM，以及NaF和EDTA。孵育结束后，以初始活性为100%测定漆酶的残余活性。
底物特异性
使用多种酚类底物（愈创木酚、鞣酸和L-酪氨酸）和非酚类底物（ABTS）测定从地衣芽孢杆菌SO8菌株纯化的漆酶的底物特异性。ABTS底物溶液用100 mM磷酸盐缓冲液（pH 6）配制，愈创木酚和鞣酸用50 mM Tris-HCl（pH 7.0）缓冲液配制，L-酪氨酸也用50 mM Tris-HCl（pH 7.0）缓冲液配制。漆酶活性最高的底物活性设为100，计算其他底物的相对活性（%）。
酶动力学
为确定从地衣芽孢杆菌SO8纯化的漆酶的动力学参数，测定了ABTS底物在50–1000 µM范围内不同浓度下的活性。用所得值绘制Lineweaver-Burk图，利用该图计算Km、Vmax、Kcat和催化效率（Kcat/Km）。
染料脱色
反应混合物由0.5 mL染料溶液、0.5 mL漆酶和1 mL 0.5 mM ABTS介体溶液组成。该混合物在55°C下分别孵育15、30、60和120 min，每次孵育在不同初始pH值（5.0、7.0和9.0）下进行。孵育结束后的剩余染料浓度在最适波长下用分光光度法分析。染料脱色百分比按以下公式计算：脱色率（%）= [(Ci − Ct)/Ci] × 100。其中Ci为染料的初始浓度，Ct为剩余染料浓度。
统计分析
所有涉及从地衣芽孢杆菌SO8分离的漆酶的实验均进行三次重复（n = 3）。数据以平均值±标准差（SD）表示，代表三次独立实验的平均值和变异性。漆酶表征数据的统计分析使用GraphPad Prism®软件（版本9.0，GraphPad Software，San Diego，CA）进行Student双尾t检验。
研究结果
酶的分离与纯化
为获得耐受极端条件的漆酶，选择了本实验室先前分离鉴定的耐热细菌中活性最高的地衣芽孢杆菌SO8菌株。TPP作为一种简单、快速、一步式生物分离技术，被用于从细菌液体培养物中纯化漆酶，以替代昂贵、耗时、多步骤的传统方法。首先，为以最高产率通过TPP方法纯化从地衣芽孢杆菌SO8菌株分离的漆酶，对叔丁醇、硫酸铵、pH和比例等参数进行了优化。优化纯化条件对于实现高酶纯度和产率至关重要。图1展示了各参数对匀浆中漆酶纯化系数和产率的影响。
最佳条件确定为70%（w/v）硫酸铵浓度、1.0:1.0匀浆液:叔丁醇比例和pH 9.0，实现5.65倍纯化和102.07%的产率（图1）。表1总结了使用TPP纯化SO8漆酶的整体纯化情况。在优化条件下，TPP有效从地衣芽孢杆菌SO8粗提物中纯化漆酶，实现102.07%的产率和5.65倍纯化。叔丁醇浓度的增加导致有机相吸水量增加，提高水相盐度，从而促进蛋白质在界面沉淀。漆酶在TPP过程中通常分配到界面相。产率超过100%是TPP方法在纯化过程中去除抑制剂并激活酶的结果。此外，TPP过程中使用的硫酸铵和叔丁醇的联合效应可能引起酶三维构象的积极变化，使其转变为更活跃的结构。
既往研究已证明TPP适用于漆酶的高产率纯化。例如，一项研究报告了糙皮侧耳漆酶的27.8倍纯化和161%产率。Rajeeva和Lele（2011）使用两阶段TPP对灵芝属漆酶实现了60%产率和13.1倍纯度。Liu等人报道了TPP纯化漆酶的20倍纯度和约75%产率。与其他常用方法相比——如硫酸铵沉淀-固定化金属亲和色谱法纯化糙皮侧耳漆酶（46倍纯化，57.4%产率）、超滤法纯化灵芝属漆酶（3.7倍纯化，90.4%产率）以及超滤法纯化革盖菌属漆酶（2.14倍纯化，87%产率）——TPP通常表现出更优的纯化产率。
SDS-PAGE分析
SDS-PAGE分析证实了TPP对漆酶纯化的有效性（图2）。与粗酶提取物（泳道a）和水相（泳道b）相比，仅在中间相（泳道c）观察到单一蛋白条带。这一观察强烈表明TPP有效去除了污染蛋白和其他分子，使中间相富集了目标漆酶。根据SDS-PAGE分析，纯化的地衣芽孢杆菌SO8漆酶的分子量约为38.7 kDa。该分子量落在其他细菌物种漆酶的报道范围内，如B. tequilensis SN4漆酶的32 kDa、屎肠球菌A2漆酶的50.11 kDa以及节杆菌属P39漆酶的160 kDa。
pH和温度对酶活性和稳定性的影响
从地衣芽孢杆菌SO8菌株纯化的漆酶的最适pH测定为9.0，表明其是一种碱性酶（图3A）。漆酶在宽pH范围（pH 2.0–11.0）内保持超过50%的活性（图3B）。观察到SO8菌株分离的漆酶在高pH值下保持稳定，在所有pH值下120 min结束时仍保留超过35%的活性。在高pH值下表现活性并保持稳定的漆酶在工业上需求很高。虽然在60 min时观察到相对活性下降，但120 min时相对活性的恢复和增加表明酶对极端条件的抗性，代表了初始环境胁迫后的结构恢复和激活过程。来自链霉菌和Thioalkalivibrio的耐碱漆酶大多起源于芽孢杆菌属。
为确定地衣芽孢杆菌SO8漆酶的温度谱和稳定性，在20°C至90°C之间进行了研究，结果显示在70°C时表现出最大活性，在20–90°C范围内保持高活性（图3C）。漆酶的活性测定在20°C至90°C之间以周期性间隔进行120 min。观察到漆酶在所有研究温度下2 h孵育期间显著保持其活性（图3D）。漆酶的高耐热性是其进化适应的结果，这得益于其含有的致密碳水化合物基团、强二级结构键，尤其是其细菌来源。在这些温度范围内长时间不失去活性很重要，因为纺织厂的废水可能处于高温状态。冷却水既需要时间也需要资源。先前的研究已证明多种来源漆酶的显著热不稳定性。例如，Koschorreck等人（2008）报道真菌漆酶在70°C下2 h后活性丧失92%，而Halaburgi等人（2011）观察到C. cladosporioides漆酶在80°C下5 min内活性丧失52%。相比之下，地衣芽孢杆菌SO8漆酶表现出卓越的热稳定性。
金属离子、抑制剂和表面活性剂的影响
研究了各种金属离子（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺）对地衣芽孢杆菌SO8漆酶活性的影响。在1和5 mM浓度的Fe²⁺和Mn²⁺离子存在下，漆酶活性增加。在其他金属离子存在下，酶活性受到不同程度的影响。
酶动力学
对ABTS底物的动力学参数测定结果为：Km为110 µM，Vmax为19.6 µmol L⁻¹ min⁻¹，kcat为0.048 s⁻¹，kcat/Km为0.44 s⁻¹ mM⁻¹。
染料脱色
染料脱色实验表明，在pH 5、7和9条件下，六种不同染料在120 min孵育期间的脱色效率为中等水平，其中酸性红27（Acid Red 27）的脱色率最高，达到38%。
讨论与解读
本研究成功采用三步相分离法（TPP）对地衣芽孢杆菌SO8漆酶进行了一步纯化。TPP被证明是一种快速、经济且高效的替代方案，实现了5.65倍纯化和102%的产率。纯化的漆酶在宽pH范围（2.0–11.0）和温度范围（20–90°C）内表现出卓越的稳定性。值得注意的是，它在高温下保留了92%的活性，超过了文献中报道的许多细菌漆酶的热稳定性。此外，该酶对多种金属离子（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺）、化学物质/抑制剂（NaF和EDTA）和表面活性剂（SDS、Triton X-100、Tween-20、Tween-80）表现出显著耐受性。这种稳健的稳定性，加上其广泛的活性谱和脱色潜力，使地衣芽孢杆菌SO8漆酶成为多种工业应用（特别是生物修复）的有前景候选者。
编译者解读
本研究选择TPP这一非色谱纯化策略，契合了工业酶制剂对低成本、可放大工艺的迫切需求——102%的回收率暗示该法在去除抑制物的同时可能激活了酶构象，这一现象在传统纯化中罕见。38.7 kDa的分子量低于真菌漆酶的典型范围，反映了细菌漆酶的结构精简性。然而，染料脱色率最高仅38%，且需依赖ABTS介体，提示该酶在实际废水处理中可能需配合介体系统或酶工程改造以提升应用价值。未来若能在反应器规模验证其长期操作稳定性，将更具说服力。
参考来源
Yıldırgan S, Aygün E, Altintas R, Şişecioğlu M. Purification of laccase from thermophilic Bacillus licheniformis SO8 with three-phase partitioning, characterization, and usage in dye decolorization. 3 Biotech. PMID: 42179929.
PMID: 42179929